一种用于Vip3A基因检测的实时荧光检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术“一种用于Vip3A基因检测的实时荧光检测方法及其试剂盒”涉及转基因检测领域。通过设计针对Vip3A基因特异序列的特异引物，应用PCR扩增技术，实现了Vip3A基因的快速检测。该方法特异性强，灵敏度高和稳定性好，对于提高Vip3A基因检测的准确性、缩短检测时间具有重要的作用。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】-种用于Vi p3A基因检测的实时巧光检测方法及其试剂盒 摘要 本专利技术属于生物
，设及转基因植物及其产品的检测方法，具体设及Vip3A实时 巧光PCR检测引物、探针、方法及试剂盒。本方法首先公开了用于精准检测转基因玉米中 Vip3A的特异性引物对和探针。在此基础上，本专利技术建立了一种特异性强、灵敏度高的Vip3A 的实时巧光PCR检测方法。本专利技术进一步公开了一种Vip3A的实时巧光PCR检测试剂盒。实验 证明，本专利技术提供的Vip3A实时巧光PCR检测引物、探针、方法及试剂盒具有特异性强、灵敏 度高等优点，适用于Vip3A的特异性精准检测。
本专利技术属于生物
，设及转基因植物及其产品的检测方法，具体设及转基 因玉米中Vip3A的实时巧光PCR检测引物、探针、方法及试剂盒，适用于Vip3A的特异性精准 检测。
技术介绍
Vip3A是一种来自苏云金芽抱杆菌的抗鱗翅目昆虫蛋白基因。先正达公司将Vip3A 转入玉米中，开发了转基因玉米MIR162品系。 目前含有Vip3A基因的转基因玉米MIR162在美国、加拿大、阿根廷和己西获得了种 植批准，已经投入商业化生产。我国农业部已经批准MIR162转基因玉米用于加工原料。目 前，已经有针对MIR162品系插入位点侧翼序列的检测方法，尚无针对Vip3A实时巧光PCR检 测方法。[000引本研究通过设计针对Vip3A的特异引物、探针，开发了实时巧光PCR检测方法及试 剂盒，实现了 Vip3A的高效灵敏快速检测。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供用于检测Vip3A基因的特异性引物、探针 本专利技术需要解决的另一问题是提供包含上述引物、探针的PCR检测试剂盒。 本专利技术用于检测Vip3A基因的PCR引物、探针序列为： 上游引物 Vip3A-F: 5'一AACGACGACGGCGTCTACA-3' 下游引物 Vip3A-R: 5'一CTCGCGCAGGTAGCTCTTACA-3' 探针 Vip3A-P: 5'FAM-TGACCCCGATCAACGGCTTTGG-册Q1 3' 本专利技术的Vip3A基因检测试剂盒，包括W下成分： (1 )Vip3A玉米DNA模板和阴性对照玉米DNA模板 (2)Vip3A基因上下游引物、探针： 上游引物 Vip3A-F: 5'一AACGACGACGGCGTCTACA-3' 下游引物 Vip3A-R: 5'一CTCGCGCAGGTAGCTCTTACA-3' 探针 Vip3A-P: 5'FAM-TGACCCCGATCAACGGCTTTGG-册Q1 3' (3) 10XExTaqBuffer，孤出0,2.5mMdNTP，抓/μlExTaq服 (4) 判定结果:若无 Ct值或Ct值大于等于40,可W判定该样品中不含有Vip3A基因；若Ct 值小于35,并且出现典型扩增曲线，可W判定该样品含有Vip3A基因；若Ct值介于35到40之 间，并出现典型扩增曲线，则需要重新提取样品基因组DNA，再次进行实时巧光PCR检测，若 检测结果Ct值仍小于40并出现典型扩增曲线，可判定该样品含有Vip3A基因。 与现有技术相比，本专利技术的进步在于:检测速度快，节省时间，特异性强，灵敏度 高，稳定性好，适合口岸检疫实验室快速鉴定转基因玉米中Vip3A基因片段。【附图说明】 图1为Vip3A基因检测试剂盒特异性测试结果，1-8号为8个不同的转基因玉米品 系，分别为 M0N89034、化ll、Btl76、TC1507、MIR604、M0N88017、MIR162、M0N863,9号为非转基 因玉米。从图1可W看出，含有Vip3A的7号样品MIR162玉米品系Ct值小于35,并且出现典型 扩增曲线，其他对照样品玉米均不含Vip3A基因，无扩增曲线，用本试剂盒能准确地检测出 Vip3A基因。【具体实施方式】 PCR引物、探针设计： 根据Vip3A基因序列，利用Primer巧.0软件，在Vip3A基因序列上设计一组实时巧光 PCR引物、探针，由Invitrogen (上海英俊生物技术有限公司）公司合成： 上游引物 vip3A-F: 5'一AACGACGACGGCGTCTACA-3' 下游引物 vip3A-R: 5'一CTCGCGCAGGTAGCTCTTACA-3' 探针 vip3A-P: 5'FAM-TGACCCCGATCAACGGCTTTGG-册Q1 3' 样品来源 本实验测试了 9个玉米种类，其中包括8个转基因玉米品系，1个非转基因玉米，见下 表：实施例l、Vip3A的检测 DM提取:按照TIANamp Genomic DNA Kit组织基因组DM提取试剂盒说明书进行操作， 提取包括玉米MIR162等共9个样品的基因组DNA，溶于lOOuL TE中，-20°C保存备用。 扩增：W无菌水作为空白对照，分别W9种玉米基因组DM作为模板，进行PCR扩增。 PCR反应体系：?〇?反应条件:95°(3预变性2 111111，95°(3变性1〇3,60°(3退火3〇3,40个循环，4°(3降 溫〇 结果： 从图1可W看出，7号样品为含有Vip3A的MIR162玉米品系，Ct值小于35,并且出现典型 扩增曲线，其他对照样品玉米均不含Vip3A基因，无扩增曲线。结果表明，本专利技术中的Vip3A 特异引物、探针只能对Vip3A基因进行扩增，形成典型扩增曲线，其它阴性对照都没有出现 扩增曲线，显示了该引物、探针良好的特异性。【主权项】1. 一种用于Vip3A基因检测的特异性引物、探针，其特征在于，序列为： 上游引物 Vip3A-F: 5'一AACGACGACGGCGTCTACA-3' 下游引物 Vip3A -R: 5'一CTCGCGCAGGTAGCTCTTACA-3' 探针 Vip3A -P: 5' FAM-TGACCCCGATCAACGGCTTTGG-B册1 3'。2. -种用于检测Vip3A基因的试剂盒其特征在于，包括如下成分： (1) 阳性对照MIR162玉米DNA模板和阴性对照玉米DNA模板 (2) Vip3A基因上下游引物、探针 上游引物 Vip3A -F: 5'一AACGACGACGGCGTCTACA-3' 下游引物 Vip3A -R: 5'一CTCGCGCAGGTAGCTCTTACA-3' 探针 Vip3A -P: 5' FAM-TGACCCCGATCAACGGCTTTGG-B册 13' (3) 10XTaq PCR Buffer，dd出0,2.5mM dNTP，5υ/μ1 Taq酶。3. -种Vip3A基因的快速检测方法，包括如下步骤： (1) PCR反应体系：(2) PCR反应条件：95 °C预变性2 min，95 °C变性10s，60 °C退火30 s，40个循环，4 °C降溫 (3)判定结果:若无 Ct值或Ct值大于等于40,可W判定该样品中不含有Vip3A基因；若 Ct值小于35,并且出现典型扩增曲线，可W判定该样品含有Vip3A基因；若Ct值介于35到40 之间，并出现典型扩增曲线，则需要重新提取样品基因组DNA，再次进行实时巧光PCR检测， 若检测结果Ct值仍小于40并出现典型扩增曲线，可判定该样品含有Vip3A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于Vip3A基因检测的特异性引物、探针，其特征在于，序列为：上游引物 Vip3A‑F： 5’—AACGACGACGGCGTCTACA—3’下游引物 Vip3A ‑R： 5’—CTCGCGCAGGTAGCTCTTACA—3’探针     Vip3A ‑P： 5’ FAM—TGACCCCGATCAACGGCTTTGG—BHQ1 3’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵璟源，王仲敏，胡佳续，于尧，贺艳，张裕君，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：天津;12