本发明专利技术公开了一种干酪乳杆菌抗菌肽及其多抗的制备方法。本发明专利技术抗菌肽是以干酪乳杆菌发酵的天然细菌素（抗菌肽）产物为模板人工设计并合成的一种小分子多肽，包括16个氨基酸残基，其氨基酸序列为：MDSLKTLLVANRGEIV，其多克隆抗体制备步骤如下：(1)干酪乳杆菌抗菌肽的设计与合成；(2)合成多肽与载体蛋白交联；(3)用干酪乳杆菌多肽免疫原进行动物免疫；(5)从免疫后的动物体内取血，收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗干酪乳杆菌多肽的抗体。本发明专利技术干酪乳杆菌抗菌肽具有分子量小、人工合成简单的特点。用本发明专利技术方法制备抗体具有特异性好和高效价的特点，为干酪乳杆菌发酵产生细菌素（抗菌肽）的检测领域的应用提供了重要工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种多肽及其抗体的制备方法，特别是用于针对干酪乳杆菌抗菌肽和抗干酪乳杆菌抗菌肽多克隆的抗体及其制备方法。
技术介绍
随着人们生活和健康水平的不断提高，人们对绿色食品的需求越来越大，食品安全意识也越来越高。而在全球应用了半个多世纪的饲用抗生素，虽然在提高饲料利用率、改善畜产品产量、增加畜牧业养殖效益等方面发挥了巨大作用；然而，随着抗生素的广泛应用甚至滥用，不仅造成耐药性菌株的产生，也会造成畜产品的药品残留，带来食品安全隐患。因此，研究开发安全、高效的新型饲用抗生素替代产品成为热点。随着研究的深入，国内外学者发现抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)具有非常优良的特性:如可抑制多种病原微生物，具有较好的选择性杀菌效果；易被消化道中的一些蛋白酶(如胰蛋白酶、靡蛋白酶等)所降解，在动物体内不产生蓄积性积累；无毒副作用、无残留、无抗药性，避免农用抗生素通过食物链的传递对人体产生的威胁，同时也不污染环境；总之抗菌肽有类似抗生素饲料添加剂的有益作用，符合畜产品安全生产的需要，适合在饲料生产中使用，具有作为新一代饲料添加剂的潜质。但到目前为止，抗菌肽的作为饲料添加剂大规模应用在饲料业还是屈指可数。另外，在我国，干酪乳杆菌行业发展尚处于起步阶段，国内干酪乳杆菌行业生产商或销售商销售量较低，其大批量使用的干酪乳杆菌菌种及发酵剂大都来自国外知名厂商，因此干酪乳杆菌行业还有较大的发展空间；目前干酪乳杆菌在食品，特别是乳制品中有一定的应用，但在饲料中添加的研究还很少，且国内的学者对干酪乳杆菌产细菌素(又名抗菌肽)的生产工艺研究及其检测还在起步阶段，而商业化产品也很有限。目前，有关干酪乳杆菌细菌素(抗菌肽)专利申请如下:申请号:201010277557.1，专利技术名称“一种干酪乳杆菌细菌素及其在饲料中的应用”，该专利涉及一种干酪乳杆菌细菌素及其在饲料中的应用，并具体公开了一株干酪乳杆菌所述的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，保藏名称为干酪乳杆菌LyT-7，其保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC NO:M2010197,以及生产细菌素的方法，和细菌素粗提物在饲料中的应用；提供了一种干酪乳杆菌细菌素，它对热、酸稳定，能被蛋白酶降解，抑菌谱广，具有作为饲料添加剂应用的前景。但是对于干酪乳杆菌发酵生产工艺和作为饲料添加剂的大规模生产工艺不涉及，也不涉及检测细菌素(抗菌肽)快速检测。申请号:201310162105.2，专利技术名称为“一种干酪乳杆菌发酵液在饲料中的应用”，公开一种干酪乳杆菌LyT-7的发酵液在饲料中的应用，具体公开了该菌株的大规模发酵获得的干酪乳杆菌发酵液，通过喷雾干燥并经加入脱毒后的油菜饼制成的饲料添加剂。但是对于具体的发酵液的细菌素(抗菌肽)的快速精确检测，未有进一步的披露；因此为了适应大规模发酵生产中对于细菌素(抗菌肽)效价的迫切需要，一种快速检测细菌素(抗菌肽)效价的方法研究很有必要。而免疫学的检测方法因特异性强、灵敏度高和操作简便等优点而备受青睐。但目前针对干酪乳杆菌细菌素(抗菌肽)的研究所用的抗体，市场上尚无商业化产品。因此，如何获得特异性强、效价比高的抗体就成了研究中亟待解决的问题，但是受天然细菌素本身的理化性质，高纯度目的细菌素获得并非易事，从而影响了相应多克隆抗体的获得；基于以上原因，我们拟人工合成干酪乳杆菌抗菌肽，并制备相关的干酪乳杆菌抗菌肽多克隆抗体，对进而干酪乳杆菌抗菌肽的快速检测提供基础。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种干酪乳杆菌抗菌肽的合成。本专利技术利用该菌株产生的一种对热、酸碱稳定，具有广谱抑菌性的天然细菌素(又名抗菌肽)，对该细菌素进行结构分析后，人工合成。 该干酪乳杆菌的保藏单位是:中国典型培养物保藏中心，保藏地址是:中国.武汉.武汉大学，保藏时间是:2010年08月09号，保藏号是:CCTCC NO:M2010197，其分类命名为:干酪乳杆菌 lyT-7 (Lactobacillus casei lyT-7) ο本专利技术的目的通过如下技术实现: 步骤一:所述天然细菌素按照以下方法得到:用于培养干酪乳杆菌lyT-7的培养基为:葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%。所述培养温度为30°C，静置培养48h ;得到的发酵液离心取上清。步骤二:向该上清液加入硫酸铵至终饱和度50%进行盐析；然后离心取沉淀，将沉淀物装入流量为1000的透析袋中在纯水中透析，并用聚乙二醇浓缩，得到细菌素粗提物；将该细菌素粗提物进一步进行经Sephadex G-100凝胶柱纯化；将收集到的细菌素样品进行RP-HPLC分离，得到最终的有抑菌活性的细菌素。步骤三:采用质谱仪对最终得到的细菌素进行结构分析。此细菌素包含16个氨基酸残基，其全序列为:MDSLKTLLVANRGEIV (N-C)。步骤四:采用固相化学合成法，用多肽自动合成仪合成人工干酪乳杆菌抗菌肽。在合成所述多肽序列时，在其C端增加一个半胱氨酸，以方便与载体蛋白偶联。步骤五:将合成的多肽使用高效液相色谱进行纯度测定，并使用电喷射质谱法对合成多妝进彳丁鉴定，完成多妝的制备。本专利技术的另一目的在于提供一种特异性好、纯度高、可与天然的干酪乳杆菌细菌素(抗菌肽)特异识别的多肽多克隆抗体及其制备方法。所述的干酪乳杆菌抗菌肽多克隆抗体通过以下技术方案实现: 步骤一:将纯化后的抗菌肽与钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH )偶联制备得到免疫原，与牛血清蛋白(Bovine albumin，BSA)偶联制备得到包被原。步骤二:得到的免疫抗原与福氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，对新西兰白兔进行颈背部皮下多点注射，初次免疫后，每2周免疫I次，进行3次加强免疫。步骤三:最后一次加强免疫10天后，将兔子处死，颈动脉取血。收集、分离得到含有兔抗干酪乳杆菌抗菌肽抗体的血清。步骤四:将抗血清通过用亲和层析法进行肽亲和纯化，得到干酪乳杆菌抗菌肽抗体。步骤五:对干酪乳杆菌抗菌肽抗体进行ELISA效价检测。【附图说明】图1:显示了干酪乳杆菌抗菌肽合成的纯度分析的HPLC检测结果。其中表示目的峰，纵坐标表示洗脱峰在220nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间。图2:显示了干酪乳杆菌抗菌肽合成的一级结构分析的质谱图。其中纵坐标表示相对丰度(％)，横坐标表示质荷比(m/z )。【具体实施方式】下面的实施例进一步说明本专利技术的实质性内容，应理解，这些实施例仅用于解释本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。实施例1:干酪乳杆菌抗菌肽的设计和合成 当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种干酪乳杆菌抗菌肽的合成和抗体制备，所述的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）保藏名称为干酪乳杆菌LyT‑7，其特征在于：干酪乳杆菌发酵液中的保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2010197，其特征在于：以干酪乳杆菌LyT‑7发酵液中的天然细菌素（抗菌肽）产物为模板人工合成一种抗菌肽，并针对这种抗菌肽制备其抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵建，王敏，曹玫，李宁浙，吴道艳，彭静珊，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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