本发明专利技术公开了一种豆状囊尾蚴囊液蛋白的分离纯化和免疫原性检测的方法，包括超滤离心管的预处理、囊液蛋白的处理、离心处理、收集大分子量目的蛋白和小分子量目的蛋白，并对纯化的分子量大小不同的囊液蛋白进行抗原性检测等步骤。本发明专利技术操作简单，时程短，效率高，作用超滤膜更加灵敏准确，获取的纯化蛋白浓度更高更纯，蛋白回收量大，并能获得抗原性强的纯化蛋白。本法是比较理想的分离纯化囊液蛋白及检测纯化蛋白免疫原性的新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及囊液蛋白分离和免疫领域，具体涉及一种豆状囊尾蝴囊液蛋白的分离 纯化和免疫原性检测的方法。
技术介绍
兔豆状囊尾蝴病（Cysticercosis pisiformis in rabbit)是由豆状囊尾蝴寄生 于家兔等啮齿类动物的肝脏、大网膜、肠系膜和腹腔内引起的一种常见多发病。本病呈世界 性分布，我国发生更为严重。据报道，从东北部的黑龙江、辽宁，到西北部的青海和新疆，从 西南的四川、重庆和贵州，到东南部的福建和华南的广西，再到华中的河南，华东的浙江和 山东等省，均有本病的发生，发病病率从5 %到100 %不等，平均感染率达到40 %左右，死亡 率在4 % -20 %之间。家兔感染豆状囊尾蝴后，临床上的主要表现为被毛松散、消化不良、腹 胀、消瘦、生长发育迟缓，影响皮毛质量和肉品质量，幼兔感染后常可引起大批死亡。因此， 本病给养兔业造成重大的经济损失。 目前，我国还没有可供诊断兔豆状囊尾蝴病的血清学方法。这可能与豆状囊尾蝴 的抗原成份多、结构复杂、特异性差、且非特异变化明显有关。在总结前人研究的基础上，本 研究发现豆状囊尾蝴的囊液蛋白，作为一种分泌性抗原，具有良好的抗原性，通过对囊液蛋 白的分离和纯化，可作为免疫抗原或制备抗血清，在临床上对豆状囊尾蝴病进行诊断。
技术实现思路
为了从豆状囊尾蝴的囊液中筛选出抗原性好，反应原性强的囊液蛋白，本专利技术提 供了一种豆状囊尾蝴囊液蛋白的分离纯化和免疫原性检测的方法。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为： -种豆状囊尾蝴囊液蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤： S1、取IOOkDa的超滤管、50kDa的超滤离心管各两个，分别用超纯水润洗干净后， 倒满超纯水，置于4°C冰箱内，预冷5-10min ; S2、取1200 μ L全囊液蛋白与等体积的超纯水混合均匀后，得2400 μ L样品； S3、提前开启离心机降温至4°C，将预处理好的两个IOOkDa的超滤离心管取出，弃 去管内超纯水，各自加入1200以1^样品，离心处理30-3511^11 ; S4、离心后，取出超滤离心管，吸取500 μ L超纯水吹20-30,将位于超滤管内管里 的大于IOOkDa的蛋白收集于干净的小离心管内，-80°C保存备用，并将位于超滤管的外管 内的小于IOOkDa的蛋白直接收集于干净的IOmL离心管内； S5、提前开启离心机降温至4°C，将预处理好的两个50kDa的超滤离心管取出，弃 去管内超纯水，分别加入等量的步骤S4收集的小于IOOkDa的蛋白，离心处理30-35min后， 用500 μ L超纯水30-40次吹打50-100kDa的样品，收集于小离心管内，-80°C保存备用，并 将小于50kDa的蛋白直接收集于IOmL离心管内，-80°C保存备用。 本专利技术还提供了一种豆状囊尾蝴囊液蛋白抗原性检测方法，采用PVC-Dot-ELISA 检测方法筛选纯化蛋白的抗原性，分别以切胶回收的纯化蛋白和经过超滤离心管分离的纯 化蛋白作为包被原进行包板，一抗为全囊液蛋白免疫小鼠所制备的抗血清，二抗为辣根过 氧化物酶（HRP)标记的山羊抗鼠 IgG，具体包括如下步骤： Sl、按10 μ g/mL (用PBS稀释）的浓度包被96孔PVC板，每孔50 μ L，每种纯化蛋 白各自包被一行（12孔），4°C过夜，PBST洗涤3次，每次间隔5min ; S2、用含5%脱脂奶粉的PBST封闭液封闭，每孔200 μ L，37°C，封闭2h，PBST洗涤 3次，每次间隔5min ; S3、分别加入一抗，每行留四个孔，三个空为阴性对照，一个空为空白对照，第一空 按照1 : 100开始，依次进行倍比稀释到1 : 12800, 37°C，反应30min，PBST洗涤3次，每 次间隔5min ; S4、加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，稀释比例按1 : 5000,每孔50 μ L， 37°C，反应30min，PBST洗涤3次，每次间隔5min ; S5、加底物显色液，每孔50 μ L，反应5min ; S6、加终止液，每孔50 μ L，立即读数； S7、用酶标仪在450nm下测量96孔PVC反应板各孔的OD值，并保存。 本专利技术具有以下有益效果： 操作简单，时程短，效率高，而且超滤管分离法比常规的SDS-PAGE分离法更加灵 敏准确，获取的纯化蛋白浓度更高更纯，蛋白回收量大，而且抗原性较强，是比较理想的分 离纯化囊液蛋白和获得抗原性好的囊液蛋白的新方法。【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本发 明。 实施例1 用超滤管对豆状囊尾蝴囊液蛋白进行分离的方法 S1、取IOOkDa的超滤管、50kDa的超滤离心管各两个，分别用超纯水润洗干净后， 倒满超纯水，置于4°C冰箱内，预冷5-10min ; S2、取1200 μ L全囊液蛋白与等体积的超纯水混合均匀后，得2400 μ L样品； S3、提前开启离心机降温至4°C，将预处理好的两个IOOkDa的超滤离心管取出，弃 去管内超纯水，各自加入1200以1^样品，离心处理30-3511^11 ; S4、离心后，取出超滤离心管，吸取500 μ L超纯水吹打20-30次，将位于超滤管内 管里的大于IOOkDa的蛋白收集于干净的小离心管内，-80°C保存备用，并将位于超滤管的 外管内的小于IOOkDa的蛋白直接收集于干净的IOmL离心管内； S5、提前开启离心机降温至4°C，将预处理好的两个50kDa的超滤离心管取出，弃 去管内超纯水，分别加入等量的步骤S4收集的小于IOOkDa的蛋白，离心处理30-35min后， 用500 μ L超纯水30-40次吹打50-100kDa的样品，收集于小离心管内，-80°C保存备用，并 将小于50kDa的蛋白直接收集于IOmL离心管内，-80°C保存备用。当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种豆状囊尾蚴囊液蛋白的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、取100kDa的超滤管、50kDa的超滤离心管各两个，分别用超纯水润洗干净后，倒满超纯水，置于4℃冰箱内，预冷5‑10min；S2、取1200μL全囊液蛋白与等体积的超纯水混合均匀后，得2400μL样品；S3、提前开启离心机降温至4℃，将预处理好的两个100kDa的超滤离心管取出，弃去管内超纯水，各自加入1200μL样品，离心处理30‑35mi n；S4、离心后，取出超滤离心管，吸取500μL超纯水吹20‑30，将位于超滤管内管里的大于100kDa的蛋白收集于干净的小离心管内，‑80℃保存备用，并将位于超滤管的外管内的小于100kDa的蛋白直接收集于干净的10mL离心管内；S5、提前开启离心机降温至4℃，将预处理好的两个50kDa的超滤离心管取出，弃去管内超纯水，分别加入等量的步骤S4收集的小于100kDa的蛋白，离心处理30‑35min后，用500μL超纯水30‑40次吹打50‑100kDa的样品，收集于小离心管内，‑80℃保存备用，并将小于50kDa的蛋白直接收集于10mL离心管内，‑80℃保存备用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘耀谦，潘博，刘兴友，李瑞珍，孙玉倩，银梅，唐海蓉，张慧辉，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。