本发明专利技术公开了一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测方法及检测试剂盒。设计了2种茎环结构DNA，其中一个修饰荧光基团，另外一个修饰两个淬灭基团，在有双酚A存在的情况下，2种茎环结构DNA可不断开环杂交，从而使荧光基团和淬灭基团靠近，发生荧光能量转移，从而把荧光淬灭。本发明专利技术检测方法的信号扩增源于两个茎环DNA的不断开环互补，无需使用任何蛋白酶，操作简单，可在室温下完成反应，灵敏度高、选择性好。在其中一个茎环结构DNA上同时有2个淬灭基团，可更有效地淬灭另一茎环结构DNA上的荧光基团，从而有效地减少了荧光背景，极大地提高了检测灵敏度，检测限为0.4pM。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境分析化学领域，涉及一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A的检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
双酸A(Bisphenol A，BPA)广泛用于合成环养树脂，聚碳酸醋等多种高分子材料，随着现代包装业的快速发展，大量双酚A通过各种途径进入生态环境中，严重影响环境安全和人体健康。双酚A具有富集性，难以降解性，即使极低的浓度也会对内分泌系统、免疫系统、生殖系统产生一系列的不良影响，并与一系列癌症的发生密切相关。因此，对双酚A的检测具有重要意义。传统的双酚A检测技术主要有高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法以及酶联免疫法等，这些技术需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，难以广泛推广。而且传统的荧光检测法背景值较高，灵敏度较低，难以用于痕量污染物的检测。
技术实现思路
为了解决现有技术所存在的不足，本专利技术设计一种双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A的检测方法，并研制检测试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是:一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测试剂盒，其包括以下组分:(I)DNAl:由双酚A的核酸适体的5’端或3’端延伸至少24个碱基所形成，从5’至3’依次包括b*区域、a*区域和双酚A核酸适体区域；(2) DNA2:DNA2与DNAl的a*区域和部分双酚A核酸适体区域互补；(3) DNA Hl:DNA Hl上修饰有荧光基团，从5’至3’依次包括a、b、c和b*区域，b和b*区域互补形成茎环结构；(4) DNA H2:DNA H2上修饰有荧光淬灭基团，从5’至3’依次包括b*、a*、b和c*区域，b和b*区域互补形成茎环结构；以上DNA分子中，a、b、c区域分别与a*、b*、c*区域互补，DNA H2的c*和b区域分别与DNA H I上的c和b*区域互补形成双链，从而使得DNA Hl和DNA H2两个莖环结构打开，打开后的DNA H2中的荧光淬灭基团靠近DNA Hl的荧光基团，从而把荧光淬灭。作为优选的，所述DNA分子中，a区域的碱基数为6_9个，b区域的碱基数为12_24个，c区域的碱基数为6-9个。作为优选的，所述DNA2中至少有9个碱基与DNAl中的双酚A核酸适体区域互补。作为优选的，所述DNA Hl的b区域末端修饰荧光信号；DNA H2的3’和5’末端修饰荧光淬灭基团。作为优选的，所述双酚A的核酸适体的序列为:5’-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3，。进一步优选的，各DNA分子的序列如下所示:DNAl的序列为:5’-AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3’ (SEQ ID N0.1)；DNA2的序列为:5，-CTGACCACCCACCGGTTAACC-3，(SEQ ID N0.2)；DNA Hl的序列为:5’-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG-3’ (SEQ ID N0.3)；DNA H2的序列为:5，-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG-3，(SEQ ID N0.4)。一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测方法，包括如下步骤:(I)将DNA1、DNA2分散于缓冲液中进行杂交反应；(2)将待检样品加入步骤⑴的混合溶液中，室温反应10-60分钟；(3)加入DNA Hl和DNA H2，室温反应10-60分钟；(4)检测反应体系的荧光强度，根据建立的标准曲线计算待检样品中双酚A的浓度；其中，DNAl、DNA 2、DNA Hl和DNA H2的序列组成如上任意一项所示。 作为优选的，步骤⑴所述缓冲液为20mMTric_HCl缓冲液，pH 7.4，含有10mMNaCl 以及 1mMMgCl2。作为优选的，步骤(4)检测反应体系荧光强度的条件为:激发光490nm，发射峰530nmo双酚A核酸适体，其为如下核苷酸序列所示DNA分子或者是与其互补的核苷酸序列所不的DNA分子:5’-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3’(SEQ ID N0.5)。本专利技术的有益效果是:本专利技术检测方法的信号扩增源于两个茎环DNA的不断开环互补，无需使用任何蛋白酶，操作简单，可在室温下完成反应，灵敏度高、选择性好。在其中一个茎环结构DNA上同时有2个淬灭基团，可更有效地淬灭另一莖环结构DNA上的荧光基团，从而有效地减少了荧光背景，极大地提高了检测灵敏度，检测限为0.4pMo【附图说明】图1为本专利技术所述的检测方法的原理图；图2为对不同浓度的双酚A测的结果图；图3为特异性实验结果图。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测试剂盒，包括以下组分:(I) DNAl，双酚A的核酸适体的5’端或3’端延伸，形成DNAl，其包括b*区域、a*区域和双酚A核酸适体区域，序列如下所示:b*a*双酚A的核酸适体5’ -AGTCTAGGATTCGGCGTG—GGTTAA—CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3’ (SEQ ID N0.1)；(2)DNA2，DNA2与DNAl的a*区域和部分双酚A核酸适体区域互补，序列如下所示:a5，-CTGACCACCCACCGG—TTAACC-3' (SEQ ID N0.2)；(3) DNA Hl，5’端第24个碱基T修饰荧光基团FAM，序列如下所示:abcb*5' -TTAACC—CACGCCGAATCCTAGACT—CAAAGT—AGTCTAGGATTCGGCGTG-3' (SEQ IDN0.3)；其包括a、b、c和b*区域，b和b*区域互补形成茎环结构。(4)DNA H2，5’和3’都修饰淬灭基团Dabcyl，序列如下所示:b*a*bc*5’ -AGTCTAGGATTCGGCGTG--GGTTAA—CACGCCGAATCCTAGACT--ACTTTG-3’ (SEQ IDN0.4)其包括b*、a*、b和c*区域，b和b*区域互补形成茎环结构，DNA H2的c*和b区域分别与DNA H I上的c和b*区域互补。(5)20mMTric-HCl 缓冲液(pH 7.4，含有 10mMNaCl 以及 1mMMgCl2)。当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于双淬灭基团核酸自组装技术的双酚A检测试剂盒，其包括以下组分：（1）DNA1：由双酚A的核酸适体的5'端或3'端延伸至少24个碱基所形成，从5’至3’依次包括b*区域、a*区域和双酚A核酸适体区域；（2）DNA2：DNA2与DNA1的a*区域和部分双酚A核酸适体区域互补；（3）DNA H1：DNA H1上修饰有荧光基团，从5’至3’依次包括a、b、c和b*区域，b和b*区域互补形成茎环结构；（4）DNA H2：DNA H2上修饰有荧光淬灭基团，从5’至3’依次包括b*、a*、b和c*区域，b和b*区域互补形成茎环结构；以上DNA分子中，a、b、c区域分别与a*、b*、c*区域互补，DNA H2的c*和b区域分别与DNA H 1上的c和b*区域互补形成双链，从而使得DNA H1和DNA H2两个茎环结构打开，打开后的DNA H2中的荧光淬灭基团靠近DNA H1的荧光基团，从而把荧光淬灭。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊华，周顺桂，
申请(专利权)人：广东省生态环境与土壤研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。