本发明专利技术公开了一种用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的双重荧光PCR的检测试剂盒及引物和探针。所述检测用引物和探针为序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测斑点热群立克次体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测斑点热群立克次体的荧光探针，序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5分别为检测莫氏立克次体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：6为检测莫氏立克次体的荧光探针。本发明专利技术还提供了斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒。本发明专利技术所选引物和探针特异性非常强，且一次能检测两种立克次体病原微生物，提高效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体用引物、探针及检测试剂盒。
技术介绍
斑点热群立克次体（SFGR)和莫氏立克次体（RM)它们引起的疾病分别称为斑点热 和地方性斑瘆伤寒。斑点热的地理分布较广泛，遍布于世界各大洲。斑点热群立克次体的常 见传播媒介为蜱，其次是螨、蚤。地方性斑瘆伤寒又称鼠型斑瘆伤寒，由鼠蚤传播，多散发， 症状较轻。地方性斑瘆伤寒的流行与当地的鼠患猖獗以及温度、湿度适合于蚤的孳生密切 有关，易形成地方性爆发流行。 立克次体病临床表现一般缺乏特异性，如表现为不明原因的高热、头痛、全身酸 痛、食欲不振等，常常误瘆为其它传染病，确诊主要依靠实验室检查，包括血清学检测和病 原的分离与鉴定。特异性抗体的检出一般在发病2周以后，所以血清学检测不能用于立克 次体感染的早期诊断。由于大多数立克次体不能在人工培养基上生长，需要靠动物接种、细 胞培养等对立克次体病原进行分离。立克次体病原分离操作复杂，费时费力且成功率很低。 因此立克次体的传统检测方法已逐渐被酶联免疫吸附技术、PCR技术、芯片技术等现代检测 方法所代替。如今，研宄的趋势更是进一步转向了在一个检测平台上同时检测多种致病菌， 以此缩短检测周期、减少检测成本。因此，能同时快速有效检测多种病原微生物的高通量检 测技术已成为临床疾病检测，国境口岸卫生检疫，公共安全等领域研宄的热点。 多重荧光PCR技术是在同一个反应体系中同时扩增两个或两个以上的目标基因 序列。多重荧光PCR技术可同时检测多种病原，具有快速、简便、准确、特异的优点，应用前 景十分广阔。 本研宄着重研宄影响检测鼠源性立克次体病多重荧光PCR技术方法的关键因素， 提出解决方案，促使形成技术升级的同时，形成产业化。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测斑点 热群立克次体和莫氏立克次体的核苷酸序列，包括引物和探针。 本专利技术要解决的第二个技术问题是提供快速、准确、使用方便的检测斑点热群立 克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒。 为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案： 本专利技术提供了检测斑点热群立克次体的引物和探针，具体如下： 通过序列比较，根据斑点热群立克次体（Spottedfevergroup rickettsiae,SFGR)OmpB基因的序列（GenBank:EF219464)，在其保守区 1020-1090 位置设 计一对引物及一条探针： 1)SFG正义引物（SFG-F)5,-TGACGITGGTACAGACGGTACT-3'（SEQIDNO:1); 2)SFG反义引物（SFG-R)5,-TTGAGmTGGGTTAITGCAACTTTAGAA-3'（SEQIDNO: 2)； 3)SFG探针（SFG-probe) 5' -FAM-CTGCCTTTAAAACAGC-3'-MGB(SEQIDNO:3)，该探 针的5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭基团MGB; 扩增目的片段为71bp。 通过序列比较，根据莫氏立克次体（Rickettsiamooseri,RM)0mpB基因的序列 (GenBank:KF241858)，在其保守区147-210位置设计一对引物及一条探针： 4)RM正义引物（RM-F)5, -TGirGATGGTGCAGGAITTGA-3'（SEQIDNO:4); 5)RM反义引物（RM-R)5, -TCTTCCTGTCGCTACAAAITCG-3'（SEQIDNO:5);6)RM探针（RM-probe)5,-TET-CAAACTGGCGCTGGTGT-3'-MGB(SEQIDNO:6)，该探 针的5'端标记报告荧光基团TET，3'端标记淬灭基团MGB; 扩增目的基因大小为64bp。 本专利技术还提供了一种检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒，由以 下组分组成： 1)DNA提取试剂；通常可以使用商业购买的DNA提取试剂盒或按照常规方法来提 取DNA，所述的试剂盒例如DNA提取试剂盒（TIANampGenomicDNAKit，cat.noDP304); 2)DNA标准品为：斑点热群立克次体OmpB基因片段的阳性重组质粒DNA;和莫氏 立克次体OmpB基因片段的阳性重组质粒DNA; 3)实时定量PCR反应液，其包括：PCR反应混合液，荧光定量PCR参比染料，检测 斑点热群立克次体的正义引物、反义引物和荧光探针，检测莫氏立克次体的正义引物、反义 引物和荧光探针， 优选为：2XPCR反应混合液，IX荧光定量PCR参比染料，检测斑点热群立克次体 的正义引物〇. 2yM、反义引物0. 2yM和荧光探针0. 4yM，检测莫氏立克次体的正义引物 0. 2yM、反义引物0. 2yM和荧光探针0. 4yM; 进一步地，所述PCR反应混合液（PremixExTaq?)，购自大连宝生物公司 (Takra)，货号RR390A。所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成。 4)阴性对照：DEPC水； 5)DEPC水；lmLx2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore纯水仪纯化，电阻率大于 18. 0MQ.CM〇 其中，检测斑点热群立克次体的正义引物为序列表SEQIDNo:1所示的核苷酸序 列，反义引物为序列表SEQIDNo:2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQIDNo:3所 示的核苷酸序列，其5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭基团MGB;检测莫氏立克次 体的正义引物为序列表SEQIDNo:4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQIDNo:5 所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，其5'端标记报告 荧光基团TET，3'端标记淬灭基团MGB。 本专利技术还提供了一种检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的检测试剂盒的使 用方法： 1.样品采集、运送 解剖鼠取其脾脏置于冻存管中，或将检获蜱虫置于冻存管中，将冻存管置于干冰 或液氮中运送回实验室。-70 °C冻存备用。 2.DNA提取 按照TIANampGenomicDNAKit试剂盒提供的方法提取立克次体DNA，具体方法如 下： (1)动物组织（脾组织用量应少10mg)应先打碎处理为细胞悬液，然后10,OOOrpm 离心lmin，倒尽上清，加200y1缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。 (2)加入20yIProteinaseK溶液，混匀，在56°C放置，直至组织溶解，简短离心以 去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。 (3)加入200y1缓冲液GB，充分颠倒混勾，70°C放置10min，溶液应变清亮，简短离 心以去除管盖内壁的水珠。 (4)加人200y1无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短 离心以去除管盖内壁的水珠。 (5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12,OOOrpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 (6)向吸附柱CB3中加入500y1缓冲液⑶（使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12,OOOrpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 (7)向吸附柱CB3中加入600y1漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇 12,OOO本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组用于同时检测斑点热群立克次体和莫氏立克次体的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针为序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测斑点热群立克次体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测斑点热群立克次体的荧光探针，序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5分别为检测莫氏立克次体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：6为检测莫氏立克次体的荧光探针。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田洁，郭惠琳，陆琳，田茵，赵静，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：北京;11
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