一种利用自组装石墨烯高灵敏检测蛋白质分子的方法技术

本发明专利技术提出了一种利用自组装石墨烯高灵敏检测蛋白质分子的方法，属于电化学技术领域。本发明专利技术的检测步骤包括：（1）利用纳米级的石墨纤维，制备平均尺寸为30±5nm的单层纳米石墨烯；(2)将微过氧化物酶（MP-11）和石墨烯溶液自组装，得到非共价键修饰的微过氧化物酶/石墨烯，MP-11分子均匀分布在石墨烯的表面；(3)利用电化学工作站，采用计时电流法，记录MP-11/石墨烯和电极的碰撞，石墨烯增大了MP-11分子和电极的接触面积，增大了MP-11的还原电流，因而灵敏地检测到MP-11分子。本发明专利技术克服了传统的检测设备昂贵工艺复杂的不足，而且大大提高检测的灵敏度，在电化学领域有广泛的应用前景。

Method for highly sensitive detection of protein molecules using self-assembled graphene

The invention provides a method for detecting protein molecules with high sensitivity by using self assembled graphene, which belongs to the technical field of electrochemistry. The detection step of the invention comprises: (1) the use of graphite nano fiber, preparation of an average size of 30 + 5nm single layer nano graphene; (2) the micro peroxidase (MP-11) and graphene solution self-assembly micro peroxidase / graphene non covalent modification of the surface of the MP-11 molecule uniform distribution in graphene; (3) using electrochemical workstation using chronoamperometry, recording MP-11/ collision of graphene and graphene electrodes, increasing the contact area of MP-11 molecule and the electrode, increasing the reduction current of MP-11, which sensitively detected MP-11 molecules. The invention overcomes the defects of the complicated process of traditional detection equipment, and greatly improves the sensitivity of detection, and has wide application prospect in the field of electrochemistry.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用自组装石墨烯高灵敏检测蛋白质单分子的方法，属于电化学

技术介绍
在过去的30年，单分子检测已经引起研究者的广泛关注。单分子检测可以用来研究电子迁移过程的基础理论，阐明电子迁移的基本行为和过程，这些都是传统的仅仅研究大量分子的集合体所不能解决的。单分子水平的检测对单分子范围内的研究是非常必要的，而且可以显著促进现有的传感技术的发展。最近几年，出现了一些检测单分子的技术和方法，这些方法包括：利用荧光检测分子的氧化还原状态、表面增强拉曼光谱和扫面电镜法。这些方法对单分子检测做出巨大的贡献，然而，它们也有一些不足，如这些检测方法往往需要利用先进的设备、复杂的检测过程或检测灵敏度不高；利用电化学技术检测单分子或几个分子是非常有挑战性的，因为一个具有氧化还原反应的活性分子和电极的一次碰撞过程中，对氧化还原电流只能贡献一个或几个电子。因此，利用电子转移过程检测单个分子需要一种技术手段，用来大幅度增加每个分子贡献的电子数；这种放大电流可以通过循环氧化还原过程来实现。这种方法最早由Reilley提出，被Bard及合作者用在他们开拓性的颗粒碰撞实验中。最近，Bard及同事提出了一种利用微电极检测金属纳米颗粒碰撞的新方法，即通过放大电化学催化反应产生的电流。在这个方法中，纳米粒子和微电极碰撞产生阶梯式的电流变化。Compton和合作者提出了纳米粒子和微电极的碰撞过程，纳米粒子和微电极碰撞的一瞬间，纳米粒子就成为纳米电极。随后的氧化还原反应就在纳米粒子电极上发生，而不在基体微米电极上；石墨烯是一种由单碳原子紧密堆积而成二维蜂窝状晶体结构的新型碳材料，具有优异的结构、化学和电学特性。由于其优异的电化学特性，石墨烯可以用作卓越的电极材料和传感器，用来检测酶、DNA和抗体。石墨烯可以用共价键和非共价键方法来修饰。MP-11分子可以通过非共价键方式和石墨烯结合，形成石墨烯在中间、MP-11在两面的三明治结构。石墨烯修饰的MP-11有2个显著的优点：第一，表面带负电荷的石墨烯片可以很容易地在静电场的作用下迁移到电极表面，增加碰撞几率。第二，单层分布的MP-11分子在石墨烯的两侧，形成了一个石墨烯装载MP-11分子的“车辆”，因而石墨烯“车辆”和微电极碰撞产生的电流比单个的MP-11分子产生的电流大的多。这种放大的电流很容易地被检测到；我们的专利技术受Bard和其他研究者的启发，提出了一种利用粒子-电极碰撞检测单分子的方法。用单分子修饰纳米石墨烯，这样可以增加氧化还原分子和电极的活性接触面积，当MP-11分子修饰的纳米石墨烯和微电极碰撞时，氧化还原电流被显著放大，这种被检测到的放大电流间接地反应了MP-11分子和电极的碰撞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用自组装石墨烯高灵敏检测蛋白质单分子的方法，该方法将蛋白质分子和纳米石墨烯自组装，利用电化学工作站，通过计时电流，研究石墨烯和微电极的碰撞，从而检测单分子，该方法有检测设备和工艺简单、灵敏度高的优点；为了达到上述目的，本专利技术的技术方案包括以下步骤：（1）纳米石墨烯的制备：取2g石墨纳米纤维、10mL浓硫酸和1gP2O5，混合加热至80°C，使其预氧化30min，然后在6h内冷却到室温，将混合物用蒸馏水稀释、抽滤并洗至中性，预氧化后的石墨干燥后与50mL浓硫酸混合，并缓慢加入6g高锰酸钾，搅拌，控制温度低于20°C，然后将混合物放在35°C的油浴中搅拌2h,然后加入280mL水后终止反应，向反应结束后的混合物中加入5mL30%的过氧化氢，混合物变成明黄色，所得混合物用分散在水中，然后抽滤，抽滤后的滤饼用1:10的稀盐酸清洗，然后干燥，配制浓度为0.1mg/mL的氧化石墨烯分散液50mL，然后加入50mg维生素，在室温下强力搅拌24小时，还原得到单层分布的纳米石墨烯；（2）蛋白质分子（MP-11）和石墨烯的自组装:将1mL浓度为0.186mg/mL的MP-11溶液加入1mL浓度为0.05mg/mL的纳米石墨烯溶液，搅拌12h，得到MP-11非共价键修饰的纳米石墨烯，清洗MP-11/graphene溶液以出去多余的MP-11分子，最后稀释到10mL，用同样的方法配制MP-11浓度为20、40μM的MP-11/graphene溶液；将直径为12.5μm的金电极浸渍在浓度为5mg/mL的Lomant试剂的DMSO溶液中，保持一夜，得到Lomant单层修饰的金电极，命名为Lomant/Au电极；将另一根直径为12.5μm的金电极浸渍在浓度为10mM的MPA的酒精溶液中，保持48h，将此电极命名为MPA/Au电极；（3）蛋白质分子的电化学检测:采用三电极电化学工作站测量循环伏安和计时电流。工作电极为直径2mm和12.5μm的金电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt丝为对电极。向pH=7，浓度为10mMPBS溶液中加入MP-11/graphene，记录电流和时间的关系曲线，工作电压分别为-400，-600和-800mV，数据采集时间间隔是50ms。有益效果本专利技术采用电化学方法检测纳米石墨烯修饰的单分子，实验设备和检测方法简单易行，灵敏度高，在电化学领域有广泛的应用前景。附图说明图1是MP-11和纳米石墨烯的自组装示意图；图2是单片石墨烯/MP-11和金电极碰撞检测蛋白质分子（MP-11）的原理图；图3是MP-11/石墨烯（黑色）、石墨烯（红色）和MP-11（蓝色）分别加入电解液后记录的计时电流图。金电极的直径是12.5μm，电压-400mV，数据采集间隔50ms。具体实施方式下面通过实施例进一步说明本专利技术：实施例1（1）纳米石墨烯的制备：取2g石墨纳米纤维、10mL浓硫酸和1gP2O5，混合加热至80°C，使其预氧化30min，然后在6h内冷却到室温，将混合物用蒸馏水稀释、抽滤并洗至中性，预氧化后的石墨干燥后与50mL浓硫酸混合，并缓慢加入6g高锰酸钾，搅拌，控制温度低于20°C，然后将混合物放在35°C的油浴中搅拌2h,然后加入280mL水后终止反应，向反应结束后的混合物中加入5mL30%的过氧化氢，混合物变成明黄色，所得混合物用分散在水中，然后抽滤，抽滤后的滤饼用1:10的稀盐酸清洗，然后干燥，取15mg干燥后氧化石墨烯分散于45mL水中得到氧化石墨烯分散液，将氧化石墨烯分散液稀释，用氨水调节至pH=10，用60%的水合肼20μL在95°C还原1h，得到单层纳米石墨烯溶液；（2）蛋白质分子（MP-11）和石墨烯的自组装:将1mL浓度为0.05mg/mL的纳米石墨烯溶液和1mL浓度为0.186mg/mL的MP-11混合，然后稀释到10mL并搅拌12h，得到MP-11非共价键修饰的纳米石墨烯；（3）蛋白质分子的电化学检测:采用三电极电化学工作站测量循环伏安和计时电流。工作电极为直径2mm和12.5μm的金电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt丝为对电极。向pH=7，浓度为10mMPBS溶液中加入MP-11/graphene，记录电流和时间的关系曲线，工作电压分别为-400，数据采集时间间隔是50ms；实施例2.将实施例1中步骤（3）的工作电压改为-600mV，其他同实施例1；实施例3.将实施例1中步骤（3）的工作电压改为-800本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用自组装石墨烯高灵敏检测蛋白质分子的方法，其特征是，包括以下步骤：纳米石墨烯的制备：取2 g石墨纳米纤维、10 mL浓硫酸和1 g P2O5，混合加热至80 °C，使其预氧化30 min，然后在6 h内冷却到室温，将混合物用蒸馏水稀释、抽滤并洗至中性，预氧化后的石墨干燥后与50 mL浓硫酸混合，并缓慢加入6 g高锰酸钾，搅拌，控制温度低于20°C，然后将混合物放在 35 °C的油浴中搅拌 2 h, 然后加入280 mL水后终止反应，向反应结束后的混合物中加入5 mL 30 % 的过氧化氢，混合物变成明黄色，所得混合物用分散在水中，然后抽滤，抽滤后的滤饼用1:10 的稀盐酸清洗，然后干燥，取15 mg干燥后氧化石墨烯分散于45 mL水中得到氧化石墨烯分散液，将氧化石墨烯分散液稀释，用氨水调节至pH=10，用60%的水合肼 20 μL在95 °C还原1 h，得到单层纳米石墨烯溶液；蛋白质分子（MP‑11）和石墨烯的自组装: 将1 mL浓度为0.05 mg/mL 的纳米石墨烯溶液和1 mL 浓度为0.186 mg/mL的 MP‑11混合，然后稀释到10 mL 并搅拌12 h，得到MP‑11非共价键修饰的纳米石墨烯；蛋白质分子的电化学检测: 采用三电极电化学工作站测量循环伏安和计时电流。...

【技术特征摘要】
1.一种利用自组装石墨烯高灵敏检测蛋白质分子的方法，其特征是，包括以下步骤：纳米石墨烯的制备：取2g石墨纳米纤维、10mL浓硫酸和1gP2O5，混合加热至80°C，使其预氧化30min，然后在6h内冷却到室温，将混合物用蒸馏水稀释、抽滤并洗至中性，预氧化后的石墨干燥后与50mL浓硫酸混合，并缓慢加入6g高锰酸钾，搅拌，控制温度低于20°C，然后将混合物放在35°C的油浴中搅拌2h,然后加入280mL水后终止反应，向反应结束后的混合物中加入5mL30%的过氧化氢，混合物变成明黄色，所得混合物用分散在水中，然后抽滤，抽滤后的滤饼用1:10的稀盐酸清洗，然后干燥，取15mg干燥后氧化石墨烯分散于45mL水中得到氧化石墨烯分散液，将氧化石墨烯分散液稀释，用氨水调节至pH=10，用60%的水合肼20μL在95°C还原1h，得到单层纳米石墨烯溶液；蛋白质分子（MP-11）和石墨烯的自组装:将1mL浓度为0.05mg/mL的纳米石墨烯溶液和1mL浓度为0.186mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：李达，杨文荣，刘敬权，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37