本发明专利技术属于医药技术中的药物制剂领域。公开了一种具有内化作用的酸敏感脂质体给药系统及其制备方法和应用。本发明专利技术将富有精氨酸残基的细胞穿透肽与脂质体表面长链有机酸直接偶联，结合具有酸敏感的聚乙二醇-腙键-长链有机酸偶合物，采用薄膜水化法制备了负载脂溶性药物和水溶性蒽醌类弱碱性药物的肿瘤靶向脂质体。其中，细胞穿透肽为多聚精氨酸短肽，优选GGRRRRRRRRR，聚乙二醇分子量为500Da～5000Da，优选2000Da，优化细胞穿透肽密度为磷脂的2％～8%，优选4%，聚乙二醇-腙键-长链有机酸酸偶合物的密度为磷脂的5％～20%，优选8％。本发明专利技术解决了目前脂质体细胞内化困难的问题，为抗肿瘤药物靶向亚细胞器提供了可能。本发明专利技术的给药系统基本无毒性，制备工艺简单，易于工业化应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及脂质体给药系统，尤其涉及肿瘤靶向脂质体给药系统及其制备方法， 属于医药
技术介绍
由于生物相容性、生物可降解性，载药多样性，以及能够提高药物稳定性，脂质体 已经成为一种被广泛应用的纳米载体系统。1995年第一个抗肿瘤药物脂质体制剂阿霉 素脂质体被FDA首次批准，进入临床，其明显改善了阿霉素的心脏毒性，但其药效并没 有显著提高。为了增加药物在靶区的蓄积进一步提高药效，脂质体研究领域先后出现了具 有物理靶向性的pH敏感脂质体，热敏脂质体，磁敏脂质体，配体或抗体修饰 的能够实现主动靶向的免疫脂质体以及多功能脂质体。 近20年来，靶向脂质体的修饰主要集中于受体介导，受体介导的胞吞作 用实现了药物在靶细胞的浓集。然而，当药物及其载体以胞吞作用入胞后第一步形成胞内 体，然后被溶酶体吞噬，并在溶酶体内丰富酶作用下被降解，由此造成药物难以从溶酶体逃 逸进入细胞质，限制了药物到达真正的靶点如细胞核或线粒体等亚细胞器发挥作用实现药 效。 近年来，研究发现细胞穿透肽（cell penetrating peptides, CPP)因其富含精 氨酸残基，可与细胞表面的阴离子物质，包括糖胺聚糖、膜磷脂头部等，发生强烈的相互作 用，激活细胞的摄取。尤其当CPP携载的药物进入细胞形成胞内体被溶酶体融合 后，CPP上的氨基可吸附H+，使细胞质中的Cl-内流进入，造成溶酶体内渗透压增加，最终 使溶酶体破裂，药物从溶酶体释放于细胞质和细胞核，为其充分发挥药效提供了前 提，这种效应被称作"质子海绵效应"。弗.哈夫曼-拉罗切有限公司申请了 PCT中国专利 CN103096932A，专利技术了一种具有氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQ的TAT肽的内化效力至少80%， 优选至少90%的效力内化入细胞，可携载核酸和蛋白转化或转染一个或多个细胞，在预防 和/或治疗选自癌症、免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染和炎性疾病的病症中具有一 定的用途。但遗憾的是，目前为止专利技术的细胞穿透肽（CPP)均缺乏组织和细胞特异性， 其在穿透肿瘤细胞的同时，对于正常细胞也有促摄取作用，由此造成了对正常组织的损害。 为进一步发挥CPP对肿瘤组织的选择性和靶向性，有文献报道用靶细胞特异性配体如 RGD和CPP共同修饰载体系统，利用RGD等对肿瘤的特异性将CPP "带"到肿瘤实现CPP的 穿透内化作用。另外，中国专利CN102552929A专利技术了由屏蔽肽、酶解底物肽、穿膜肽顺序连 接形成可激活细胞穿透肽，利用PSA敏感性专利技术了一种给药系统，改善了 CPP的靶向性。但 这种系统设计较为复杂不易实现大生产，以及尚存在免疫原性等问题，因此限制了其实际 应用。 此外，如我们所知，在脂质体发展过程中，用聚乙二醇（poly (ethylene glycol)， PEG)衍生物对脂质体膜层的修饰是一座历史的里程碑。然而，PEG对脂质体的修饰是 一把"双刃剑"。其在消弱了脂质体与调理素作用的同时，也将减弱长循环脂质体达到靶部 位时与靶细胞的相互作用，甚至PEG链的水化层阻碍了所连接的配体、抗体的"靶向"作用， 降低靶向输送和细胞摄取的效率。上述中国专利CN102552929A中CPP即用聚乙二醇 连接后修饰于脂质体表面，这种聚乙二醇水化层对于CPP作用的发挥具有"阻碍"作用，不 能充分发挥CPP的作用。 众所周知，肿瘤部位的pH明显低于正常组织和血液，腙键在低pH时容易水 解断裂。因此，PEG通过腙键连接于脂质体表面使得这种酸敏感脂质体能够最优发挥其在 肿瘤部位的作用，也就是说在体循环PH7. 0条件下，PEG稳定存在于脂质体表面起到"保护 作用"，而在肿瘤低pH值的酸性区域，链接PEG的腙键断裂使得PEG "离开"脂质体表面促 进细胞对脂质体的摄取。Kale，A.A. and Torchilin，V.P. ·曾经提出一种TATp修饰的 pH敏感脂质体，其中TATp通过与短链聚乙二醇（PEG1000 )-PE偶合形成TATp-PEGlOOO-PE 插入脂质体表面，聚乙二醇长链mPEG2000通过腙键与PE偶联（mPEG2000-HZ-PE)插入脂质 体表面实现酸敏感的长循环。这种酸敏感给药系统虽然在一定程度上提高了 CPP的对于肿 瘤的选择性，但依然没有考虑并改善PEG的水化层的阻碍作用，没有使CPP的作用充分发挥 出来。除此之外，长循环酸敏感部分mPEG2000-HZ-PE中所用到的PE是具有两个长链有机 酸的磷脂分子，其具有较小的临界胶束浓度，在该酸敏感脂质体制备中更易形成胶束而难 以插入脂质体表面，在制备中存在酸敏感偶合物修饰率低的问题。 针对Kale, A. A. and Torchilin，V. P.设计的这种酸敏感脂质体中存在的问题， 我们设计了一种简单有效的CPP修饰的酸敏感脂质体，其中CPP与硬脂酰（STR)直接偶联 修饰脂质体表面，避免了 PEG的"阻碍"作用，另外，用单链有机酸（如硬脂酸STR)合成了 mPEG20000-Hz-STR，其中用单链STR代替了双链PE，较（mPEG2000-HZ-PE)有更高的临界胶 束浓度，在脂质体制备中不易形成胶束，反而更容易插入脂质体表面，实现长循环性。这种 简单有效的靶向脂质体制剂兼具体内长循环、肿瘤物理靶向以及细胞穿透内化三种特性， 能同时实现抗肿瘤药物在肿瘤区的高效定位浓集和快速细胞穿透两个目的。而且该制剂制 备简单，易于大生产，对所有肿瘤具有广谱适用性，有望助于肿瘤靶向给药制剂在临床应用 上零的突破。 参考文献： . Cullis. P. R. and A. Chonn, Recent advances in liposome technologises and their applications for systemic gene delivery.Adv Drug Deliv Rev, 1998. 30(1-3) ：p. 73-83. .Ning, Y. M. , et a]. , Liposomal doxorubicin in combination wim bortezomib for relapsed or refractory multiple myeloma. Oncology(Williston Park)，2007. 21 (12) :p. 1503-8 ;discussionl511，1513,1516passim. . Evjen, T. J. , et al.，Lipid membrane composition influences drug release from dioleoylphosphatidy]ethano Iamine-based liposomes on exposure to ultrasound. Int J Pharm, 2011. 406 (1-2) ：p. 114-6. . Legendre, J. Y. and F. J. Szoka, Delivery of plasmid DNA into mammalian cell lines using pH-sensitive liposomes :comparison w本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有内化作用的酸敏感脂质体给药系统，其特征在于细胞穿透肽通过长链有机酸直接偶联于脂质体表面，同时具有酸敏感性的聚乙二醇‑腙键‑长链有机酸偶联物修饰脂质体表面。其制备工艺包括如下步骤：(1)载药普通脂质体的制备：负载脂溶性药物的方法：适量磷脂、胆固醇及其衍生物、长链有机酸，脂溶性药物溶于有机溶剂，25～60℃下旋转蒸发成膜，等渗溶液水化即得；对于水溶性蒽醌类弱碱性药物的方法：适量磷脂、胆固醇及其衍生物、长链有机酸，溶于有机溶剂，旋转蒸发成膜，加入酸性(包括有机酸或无机酸)水溶液水化，然后再调节外水相为弱碱性pH7.5～8.0，加入水溶性蒽醌类弱碱性药物孵育过夜，即得。(2)具有内化作用脂质体制备：在步骤(1)得到的载药普通脂质体溶液中，加入适量1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCl)EDCl和巯基化‑N‑羟基丁二酰亚胺(s‑NHS)活化脂质体中的长链有机酸，调节pH为10～12，再加入CPP得到具有内化作用的CPP修饰脂质体，其中CPP修饰密度为磷脂物质的量的4％～8%，优选4％。(3)具有内化作用的算敏感脂质体的制备：加入聚乙二醇‑腙键‑长链有机酸，孵育过夜。其密度为磷脂物质的量的8％～20％，优选8%。(4)用截留分子量5000Da～300000Da的透析袋透析4h～48h或用截留分子量5000Da～300000Da的超滤管在4000g～15000g离心10min～30min，即得。优选截留分子量为10000Da，透析时间12h，离心速度为10000g，离心时间为20min。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢辉，陈建华，
申请(专利权)人：谢辉，陈建华，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。