一种海洋酯酶及其编码基因E32与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种海洋酯酶及其编码基因E32与应用。海洋酯酶基因E32，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述海洋酯酶基因E32编码的海洋酯酶E32，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术所述的海洋酯酶E32能降解短链和中长链的pNP酯类(C2-C12)，具有通过分解转化生产短链或中长链脂肪酸酯类风味物质的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种海洋酯酶及其编码基因E32与应用
本专利技术涉及一种海洋酯酶及其编码基因E32与应用，属于生物技术

技术介绍
酯酶(esterases)是一种能催化酯键的水解与合成的水解酶，水解时催化酯键产生甘油和短链脂肪酸(≤10个碳原子)；合成时，把酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，产物为酯类及其他香味物质。酯酶广泛存在于动物、植物和微生物中。微生物资源丰富，并且利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产、易纯化等优点，因此微生物来源的酯酶已被广泛应用于制药业、造纸业、化妆品生产、食品加工以及食品添加剂等领域。目前，微生物酶法生产风味物质(flavors)在国际上已引起极大重视。风味物质已被广泛应用于食品、化妆品、洗涤剂和制药业中，其每年在国际市场上的需求量超过220亿美元。现在，主要通过化学合成的方法或从原材料中提取的方法来生产风味物质。化学合成的方法，其工艺复杂、反应条件剧烈、产物不均一、依赖有毒溶剂且能耗高，易造成环境污染、资源浪费，且生产成本高。从原材料中提取风味物质的方法，因其在原材料中的含量较低，因此也同样存在高生产成本的问题。但是，通过微生物酶法生产风味物质具有反应条件温和、不发生副反应以及产物单一等化学合成方法无法比拟的优点，并且可以通过制备全细胞催化剂以及循环利用来降低生产成本。因此，近年来采用生物合成风味物质逐渐成为研究热点。短链或者中长链的脂肪酸酯，因其果香味和高挥发性被普遍地用作一类重要的风味物质。而酯酶则可以通过分解转化或合成生产这类风味物质。酯酶作为生物催化剂，具有不需要辅因子、能稳定存在于有机溶剂中、高区域选择性和高立体选择性等优点。虽然酯酶存在于所有生物中，但是具有商业价值的酯酶主要来源于微生物类群。根据生化性质和氨基酸序列，微生物来源的酯类水解酶(包括酯酶和脂肪酶)主要分为8个家族，第I-VIII家族。这些酯类水解酶中，只有很小一部分应用到风味物质的工业生产中，还远远满足不了工业上对各种酯类水解酶的需求。海洋微生物不仅数量巨大，且富含多种类群，其处于不同的温度、压力、盐浓度、营养物质等环境条件下，这为获取性质独特的具有工业潜力的新型酯酶提供了巨大的来源。而分子生物学、基因组测序技术和宏基因组技术的飞速发展，大大加快了海洋来源新型酯酶的发现，这为克隆酯酶基因，构建高产的基因工程菌，以实现工业化生产奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种海洋酯酶及其编码基因E32与应用。一种海洋酯酶基因E32，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述海洋酯酶基因E32编码的海洋酯酶E32，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列的功能片段。一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组表达载体或表达上述海洋酯酶E32。上述海洋酯酶E32和/或上述海洋酯酶基因E32在水解制备风味物质中短链和中长链酯类及其衍生物的应用。本专利技术海洋酯酶的基因E32来自南海海底表层沉积物样品E505宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子E32-4A的大片段质粒fosmidDNA。通过构建E32-4A克隆子中fosmid的亚克隆文库和后期测序，确定了该克隆子fosmid上携带的酯酶基因E32的核酸序列。根据E32基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从E32-4A克隆子的fosmidDNA克隆了编码海洋酯酶E32的基因，构建了含海洋酯酶基因E32的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。测序结果表明海洋酯酶基因E32为一个含有1,455个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架共编码484个氨基酸。因此酯酶E32是一个含有484个氨基酸的多肽。序列分析表明，海洋酯酶E32属于一个酯类水解酶新家族，E32是该新家族第一个被研究的酯酶。对纯化的海洋酯酶E32进行性质测定。结果表明该酶对短链和中长链的酯类表现出较强的降解活性。最适pH为9.0，且在pH6.0-10.0范围内稳定存在。最适酶活温度为40℃，且在30-50℃范围内保持超过85％的活力。其为热稳定酯酶，对超过60℃的高温环境表现出较好的耐受性。E32对高浓度的NaCl也表现出很好的耐受性。有益效果1、本专利技术所述的海洋酯酶E32能降解短链和中长链的的pNP酯类(C2-C12)，具有通过分解转化生产短链或中长链脂肪酸酯类风味物质的应用潜力；2、本专利技术所述的海洋酯酶E32能在30-50℃和pH7.0-10.0范围内保持很高的酶活力，且对高温、高盐以及强碱表现出很好的耐受性，这为其更好地应用于工业生产奠定了基础。附图说明图1、以海洋酯酶E32及其同源序列以及已知的酯类水解酶家族代表序列构建的系统发生树；图2、通过PCR扩增克隆的编码海洋酯酶E32的基因片段的电泳图；其中：泳道1和泳道2为扩增的DNA片段，M泳道为DNA分子量标记(marker)；图3、在大肠杆菌中进行异源表达和纯化的海洋酯酶E32电泳图；其中：泳道1、含空质粒pET22b的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达菌体超声波破碎后的上清液电泳图，为阴性对照，泳道2、含重组表达质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达菌体超声波破碎后的上清液电泳图，泳道3、上清液经过镍柱亲和层析的穿过液，泳道4和泳道5、上清液经过镍柱亲和层析纯化后的纯酯酶E32电泳图，泳道M、蛋白质分子量标记(marker)；图4、海洋酯酶E32的底物特异性分析；图5、海洋酯酶E32的酶活温度曲线；其中：(A)温度对酶活性的影响，(B)温度对酶稳定性的影响；图6、海洋酯酶E32的酶活pH曲线；其中：(A)pH对酶活性的影响，(B)pH对酶稳定性的影响；图7、不同浓度的NaCl对海洋酯酶E32酶活性的影响曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术所保护范围不限于此。培养基：LB液体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。LB固体平板：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。实施例1：海洋酯酶E32编码基因序列的获取及其序列分析菌种来源：南海海底沉积物样品E505宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子E32-4A。具体步骤如下：1.1亚克隆文库的构建用OMEGA公司的BAC/PACDNA提取试剂盒按照其说明提取大肠杆菌EPI300克隆子E32-4A中的大片段质粒fosmid。然后用限制性内切酶Sau3AI(购自Fermentas公司)对提取到的fosmid进行部分消化，以获取2,000-5,000bp的DNA片段，将其连接到经BamHI消化及去磷酸化处理的pUC19质粒(购自NEB公司)上。连接反应液电转E.coliTop10感受态细胞，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素和1％(v/v)三丁酸甘油酯(购自Sigma公司)的LB固体平板，37℃倒置培养12-16h，构建成酯类水解酶活性克隆子E32-4A的fosmidDNA的亚克隆文库。1.2酯类水解酶基因序列的确定选取固体平板上产生透明降解圈的亚克隆，提取质粒并以载体特异性引物M13F/R进行测序。用GeneMark软件预测DNA序列上可能的开放阅读框架。用BLASTX在NCBInr库中对预测的开放阅读框架进行相似性搜本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋酯酶基因E32，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种海洋酯酶基因E32，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述海洋酯酶基因E32编码的海洋酯酶E32，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列的海洋...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉忠，李平一，陈秀兰，张熙颖，解彬彬，秦启龙，苏海楠，宋晓妍，石梅，周百成，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37