本发明专利技术公开了专利涉及一种净化3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮复合亲和柱及其制备方法与应用。采用4％的柱状琼脂糖凝胶作为固相载体，琼脂糖凝胶与抗体偶联形成免疫吸附剂，装柱制成免疫亲和柱。当含有3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的样品通过免疫亲和柱时，免疫吸附剂就会特异性的吸附3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮，其他的杂质则流出免疫亲和柱，然后用甲醇将3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮从柱子中洗脱下来，样品得到了很好的净化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种净化3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素 A，玉 米赤霉烯酮的方法及其专用免疫亲和柱，更确切的说是3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲 霉毒素、赭曲霉毒素 A、玉米赤霉烯酮免疫亲和柱的制备方法，免疫亲和柱净化-液相色谱 法检测3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素（B1, B2, G1, G2)、赭曲霉毒素 A和玉米赤霉 烯酮检测方法的建立。
技术介绍
3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇主要由某些镰刀菌产生，包括：禾谷镰刀菌、尖孢镰 刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌和雪腐镰刀菌等。许多粮谷类都可以受到污 染，如小麦、大麦、燕麦和玉米等。它在体内可能有一定的蓄积，但无特殊的靶器官，具有很 强的细胞毒性。人畜摄入了被3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染的食物后，会导致厌食、呕 吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡，但不 同的动物对3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的敏感程度不一，猪最敏感。另外3-乙酰脱氧雪 腐镰刀菌烯醇对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无 致癌、致突变作用。但对免疫毒性研宄结果冲突较多，尚无确凿的证据。 黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等产生的一组结构类似的次生代谢产物，是一组 以二吠喃香豆素为基本结构的化合物。目前已分离鉴定出12种，尤其是黄曲霉毒素 BpB2, G1, G2为强污染物质，广泛存在于粮食谷物和饲料及其加工品中，在目前已知的两百多种真 菌毒素中毒性最强、污染频率最高。黄曲霉毒素具有诱导突变、抑制免疫和致癌的作用。黄 曲霉毒素作用的靶器官主要是肝脏，被公认为致肝癌物质，长期食用含有低水平黄曲霉毒 素食物的人其肝脏也将受到损害。国际癌症中心将其定为一类致癌剂。 杂色曲霉素是由杂色曲霉、构巢曲霉等产生的一种具有致癌性的真菌毒素，在化 学结构上属于黄曲霉毒素前体物质，可与DNA形成加合物。杂色曲霉素产生菌及杂色曲霉 素在世界各地粮食及饲料中的污染很常见。国内学者研宄发现，我国各地粮食中杂色曲霉 素的污染非常普遍，其中以小麦最明显，污染率最高可达100%。杂色曲霉素可能与胃癌、肝 痛的发生密切相关。 赭曲霉毒素是由赭曲霉和纯绿青霉产生的一种霉菌肾毒素，可分为A和B两种类 型，A的毒性较大。赭曲霉毒素在4°C的低温下赭曲霉即可产生具有毒害作用浓度的赭曲霉 毒素。动物摄入Ippm体重剂量的赭曲霉毒素 A可在5~6天致死。常见的病变是肾小管 上皮损伤和肠道淋巴腺体坏死。饲喂含Ippm浓度赭曲霉毒素的日粮3个月可引起动物烦 渴、尿频、生长迟缓和饲料利用率降低；饲喂含量低至200ppb的日粮数周可检测到肾损伤。 其他的临床症状还有腹泻、厌食和脱水。有时临床症状不明显，而在赭曲霉毒素中毒呈地方 流行病的地区，动物在屠宰时惟一可观察到的病变是肾苍白、坚硬。 玉米赤霉烯酮又称F-2毒素，它首先从有赤霉病的玉米中分离得到.玉米赤霉烯 酮其产毒菌主要是镰刀菌属的菌侏，如禾谷镰刀菌和三线镰刀菌.玉米赤霉烯酮主要污染 玉米，小麦，大米，大麦，小米和燕麦等谷物，其中玉米的阳性检出率为45%，最高含 毒量可达到2909mg/kg ;小麦的检出率为20%，含毒量为0. 364~11. 05mg/kg.玉米赤霉 烯酮的耐热性较强，ll〇°C下处理Ih才被完全破坏.玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，主要 作用于生殖系统，可使家畜，家禽和实验小鼠产生雌性激素亢进症.妊娠期的动物（包括 人）食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流产，死胎和畸胎.食用含赤霉病麦面粉制作的各 种面食也可引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心，发冷，头痛，神智抑郁和共济失调等。 目前，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素 A和玉米赤霉烯酮的 检测方法主要有薄层层析法，酶联免疫法（ELISA)，免疫亲和层析-液相色谱法，免疫亲和 层析-荧光光度法等。薄层层析法，要接触大量的标准品，不利于实验者的健康，而且灵敏 度很低。酶联免疫法，只适用于定性检测，很容易出现假阳性和假阴性的现象。免疫亲和 层析-液相色谱法可以定量地检测许多商品中的3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒 素、赭曲霉毒素 A和玉米赤霉烯酮的含量。由于采用了先进的生物技术，该方法可以检测出 3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素（B1, B2, G1, G2)、赭曲霉毒素 A和玉米赤霉烯酮的 含量，而不使用有毒的溶剂如氯仿和二氯甲烷。因此，当务之急，要制备出性能稳定的免疫 亲和柱，并建立一种经济，快捷，精确，安全的试验方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中检测3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素（B1, B2, G1, G2)、赭曲霉毒素 A和玉米赤霉烯酮亟需性能稳定的免疫亲和柱的问题，本专利技术提供了一种 净化3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素 A、玉米赤霉烯酮复合亲和柱及 其制备方法与应用。 为了实现上述目的本专利技术采用的技术方案是： 净化3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素 A、玉米赤霉烯酮复合 亲和柱的制备，包括： a)基质制备 称取Ig琼脂糖凝胶基质粉末，溶于lmmol/L HCl中，然后置于烧结玻璃过滤器中 使用lmmol/L HCl洗涤15min ;CNBr活化的琼脂糖凝胶是以冻干形式提供，并含有添加剂。 这些添加剂必须在与目的配体偶联前在低pH(pH2-3)条件下予以洗去。 b)配体偶联 使用偶联缓冲液0. 2mol/L NaHCO3 pH8. 3溶解待偶联的3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌 烯醇抗体、黄曲霉毒素抗体、赭曲霉毒素 A抗体和玉米赤霉烯酮抗体4种抗体，获得抗体溶 液，迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所述抗体溶液中，室温条件（20-25? )下 米用end-over-end的方式充分混勾上述的混和物2_4h ; c)配体封闭 封闭所有残留的活性基团，转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0. lmol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h ; d)除去偶联后未偶联上的多余的配体 依次用0· lmol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0· lmol/L Tris-HCl缓冲液对经步骤c) 处理后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤，至少洗涤3个循环； e)装柱 用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0. 01 % NaN3-PBS洗涤，并使用0. 01 % NaN3-PBS保 存，然后装柱。 本专利技术中的亲和柱是按照上述方法制备获得的。 在此基础上本专利技术建立了免疫亲和柱净化-液相色谱法检测3-乙酰脱氧雪腐镰 刀菌烯醇、黄曲霉毒素（B 1, B2, G1, G2)、赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，当含有3-乙酰脱氧雪 腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素 A和玉米赤霉烯酮的样品通过免疫亲和柱时，免疫 吸附剂就会特异性的吸附3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素 A和玉米 赤霉烯酮，其他的杂质则流出免疫亲和柱，然后用甲醇将3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄 曲霉毒素、赭曲霉毒素 A和玉米赤霉烯酮从柱子中洗脱下来，样品得到了很好的净化。 用所述复合亲和柱净化待测样液，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，流速为I mL/ min~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种净化3‑乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮复合亲和柱，其特征在于，制备方法如下：a)基质制备称取1g琼脂糖凝胶基质粉末，溶于1mmol/L HCl中，然后置于烧结玻璃过滤器中使用1mmol/L HCl洗涤15min；b)配体偶联使用偶联缓冲液0.2mol/L NaHCO3 pH8.3溶解待偶联的3‑乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体、黄曲霉毒素抗体、赭曲霉毒素A抗体和玉米赤霉烯酮抗体4种抗体，获得抗体溶液，迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所述抗体溶液中，充分混匀上述的混和物2‑4h；c)配体封闭封闭所有残留的活性基团，转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0.1mol/L Tris‑HCl缓冲液中，室温条件下静置2‑4h；d)除去偶联后未偶联上的多余的配体依次用0.1mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0.1mol/L Tris‑HCl缓冲液对经步骤c)处理后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤，至少洗涤3个循环；e)装柱用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0.01％ NaN3‑PBS洗涤，并使用0.01％NaN3‑PBS保存，然后装柱。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王国民，郗存显，张雷，彭涛，李贤良，曹淑瑞，周超，果旗，王雄，王彦斐，江帆，
申请(专利权)人：重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中国检验检疫科学研究院，北京中检维康技术有限公司，北京中检维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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