一种桔霉素免疫亲和柱及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种桔霉素免疫亲和柱及其制备方法，属于食品安全检测领域。该免疫亲和纯化柱利用蛋白G偶联到琼脂糖凝胶载体上，然后用抗桔霉素的抗体与琼脂糖上的蛋白G偶联。然后再利用交联剂对桔霉素抗体—蛋白G-琼脂糖凝胶载体进行交联后装填亲和柱。该免疫亲和柱主要用于对于食品、饲料、调味品、酒和饮料以及其他多种样本中的桔霉素的纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种桔霉素的免疫亲和柱及其制备方法，属于食品安全检测领域。
技术介绍
红曲霉在食物中的应用已有千年的历史，近年来，由于它能够生成多种生理活性物质而备受各国的关注。然而，目前发现多种长期应用于工业生产的红曲霉在产生色素和生理活性物质的同时，还能分泌一种真菌毒素-桔霉素(Citrinin)。桔霉素分子式为C13H14O5，分子量250。在无水乙醇或苯一环己烷中呈柠檬黄针状结晶，溶点为175°C。溶于热酒精、乙酸乙酯、苯、丙酮、氯仿，在二乙醚和乙醇中微溶，不溶于水桔霉素主要作用的靶器官是肾脏，它能够破坏肾脏的近曲小管，且可以致畸、导致肿瘤的发生，而且可以诱发突变。这些研究结果都表明桔霉素在食物中存在是不安全的。 目前桔霉素常用的检测方法有薄层层析法(TLC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)等。 薄层色谱测定法(TLC)是最早建立的一种检测方法，具有简便、经济、对设备和检验人员要求不高等特点，是我国国家标准检测方法之一。但由于TLC法的精确度低，操作过程复杂，分析结果的可重复性和再现性差，一般作为桔霉素HPLC的前处理方法，且只能对桔霉素进行半定量检测。 酶联免疫吸附试验(ELISA)又称之为免疫测定法，是以免疫抗体为基础的免疫检测技术，是一类快速、灵敏且操作简单的分析方法，在毒素和有毒化合物等小分子化合物的检测中应用已十分广泛，目前已经有检测桔霉素的ELISA方法和产品。但目前检测桔霉素的ELISA方法的假阳性率偏高。 高效液相色谱方法(HPLC)高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，是定量分析桔霉素最常用的方法。但使用高效液相色谱检测桔霉素时，需要先将桔霉素样品进行净化处理，否则容易受到杂质干扰，影响检测效果。目前常用的净化处理方法就是固相萃取法，也叫柱层析法。是目前真菌毒素净化使用最广泛的方法。其中，免疫亲和柱方法的分析速度快，灵敏度高，分离效率和回收率高，安全可靠，因而成为最常用的方法。 用于目前制备免疫亲和纯化柱的方法大概有:溴化氰活化直接偶联法、环氧氯丙烷法、过碘酸钠法等。这些方法的基本原理都是将载体基质进行化学活化后，将抗体偶联到载体上。但是由于偶联是非特异性的，抗体的任何部位都有可能和载体偶联，方向性是不可控制的。势必影响亲和纯化柱纯化桔霉素的效率。
技术实现思路
本专利技术克服了现有技术中存在的一些缺点，提供和用途，从而对样品特异纯化，过柱净化后的样品液可直接用于色谱或ELISA等方法对待测物中桔霉素的含量进行检测。 本专利技术的目的在于为了达到上述目的，在本专利技术中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fe部位相结合。并且具有很高的亲和力。我们克隆了蛋白G的基因序列，并且对其密码子进行了优化、重组后，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。将基因重组的蛋白G偶联到载体上后，再将桔霉素抗体偶联到蛋白G上，制备出了桔霉素一蛋白G—载体，再用交联剂将载体进行交联。交联后的载体装柱后就形成了高亲和力的桔霉素免疫亲和柱。该亲和柱操作简便，纯化桔霉素效率高。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的桔霉素。用于高效液相色谱等的检测。 本专利技术最大的优势就是利用了蛋白G与Ig抗体特异性结合的特点，IgG抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fe区，其中，Fab区是抗原结合的区域。 蛋白G是链球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fe区域有特异性的结合能力。蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我们基因优化重组后的蛋白G，I个分子的蛋白G可以结合3个分子的IgG抗体，具有很高的抗体亲和力。并且只有抗体能与蛋白G结合，其余蛋白均不能与蛋白G结合，特异性很高。以此蛋白G为基础制备的免疫亲和柱具有特异性好，桔霉素结合量大，纯化效率高的特点。 桔霉素免疫亲和柱及其制备方法说明如下:1.载体活化选择琼脂糖载体，sepharose4B,以环氧氯丙烧活化法进行活化。 取2%的预溶胀的琼脂糖凝胶sepharose4B,用20倍体积的蒸懼水充分冲洗,洗去残存的乙醇，用漏斗过滤掉水分。 称取滤去水份后的湿凝胶5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的环氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氢化钠NaBH4，5毫升，在25°C下摇床反应8小时。 反应后，用大量的蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。 2.将蛋白G与活化载体sepharose4B的偶联将活化好的琼脂糖凝胶sepharose4B用偶联缓冲液(0.1M的NaHCO3,0.8M NaCl，PH8.9)洗涤3次。每克活化的sepharose4B加入30_200nmol的蛋白G，室温偶联2小时，或者4°C偶联过夜。偶联产物用IM Tris.HCl PH 8.0室温反应2小时。 将偶联好的琼脂糖载体用20mM，PH7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。偶联有蛋白G的琼脂糖载体sepharose命名为蛋白G_sepharose。 3.抗桔霉素抗体与蛋白G-sepharose载体上的蛋白G连接蛋白G与抗体具有特异性的亲和力，在一定的反应条件下，将偶联有蛋白G的琼脂糖凝胶与抗体进行连接，将抗体连接于琼脂糖上。由于蛋白G与抗体的结合部位是抗体的Fe区域，抗体的抗原结合区不受影响，充分保证了抗体的抗原结合能力。 将桔霉素抗体溶解在20mM PH7.4的PBS中，每克蛋白G_s印harose加入200nmol-l.2umol抗体，室温反应30分钟。 结合后的载体用PBS洗漆。连接有抗体的载体命名为抗体一蛋白G—sepharose ο 4.载体交联将抗体一蛋白G— s印harose用20mM PBS PH7.4洗涤3次。然后加入终浓度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，PH8.3，室温反应I小时。 加入20mM，PH9.0的乙醇胺终止反应，用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗漆桔霉素抗体一蛋白G —sepharose载体。 5.装柱将交联后的抗体一琼脂糖载体根据需要装入层析柱中，放于4°C保存可根据需要制备不同容量的桔霉素亲和纯化柱。 与现有技术相比，本专利技术具有如下优点:I)充分的利用了蛋白G与IgG抗体特异性结合的特性，使抗体通过蛋白G偶联到载体上。并且IgG抗体的Fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了桔霉素的捕捉能力，桔霉素的纯化效率也得到有效提高。 2)本专利技术使用了基因改造后的蛋白G，通过对密码子的优化和IgG结合域基因的优化。使蛋白G的抗体结合能力大幅度提闻，进而提闻了結霉素的纯化效率。 3)使用本专利技术纯化桔霉素操作简便，几步就可以得到纯度较高的桔霉素，更方便操作者使用。 4)使用本专利技术得到的桔霉素纯度很高，后续不用再做别的纯化处理就可以直接用于高效液相色谱检测或者荧光检测，节省了操作者的时间和费用。 【附图说明】 图1:桔霉素免疫亲和柱结构示意图A:进样口 ； B:柱体；C:筛板；D:桔霉素抗体-蛋白G-sepharose填料 E:筛板；F:出样口【具体实施方式】:桔霉素免疫亲和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桔霉素免疫亲和柱，其特征在于包含有载体、蛋白G和桔霉素抗体。

【技术特征摘要】
1.一种桔霉素免疫亲和柱，其特征在于包含有载体、蛋白G和桔霉素抗体。2.根据权利要求1中所述的桔霉素免疫亲和柱，其特征在于蛋白G通过化学键偶联在载体上，桔霉素抗体与蛋白G结合后用交联剂交联。3.根据权利要求1中所述的桔霉素免疫亲和柱，其特征在于蛋白G是基因重组表达的蛋白G。4.根据权利要求2中所述的桔霉素免疫亲和柱，其特征在于所述的蛋白G包括按照GenBank CAA27638.1序列表达的蛋白G，以及进过序列优化后表达的蛋白G。5.根据权利要求3中所述的桔霉素免疫亲和柱，其特征在于所述的序列优化的蛋白G，包括针对大肠杆菌表达进行的蛋白G密码子进行优化、对蛋白G进行抗体结合区域进行序列改变以增加亲和力以及增加蛋白G基因序列中抗体结合区域数量以提高抗体亲和能力。6.根据权利要求1中所述的桔霉素免疫亲和柱，其特征在于所述的载体是琼脂糖凝胶。7.根据权利要求6中所述的免疫亲和柱，其特征在于所述的琼脂糖凝胶包括有溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶以及纤维素。8.根据权利要求6中所述的桔霉素免疫亲和柱，其特征在于所述的抗桔霉素抗体包括单克隆IgG抗体和多克隆抗体。9...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳家鹏，
申请(专利权)人：北京华安麦科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11