一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置和方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于泵浦-探针技术的超分辨方法，第一光束照射样品并使样品的原子跃迁至激发态，第二光束经相位调制后在样品上形成空心光斑并激发信号光，第三光束在样品上形成实心光斑并激发信号光；其中，控制第三光束的频率为V1，探测频率为V1的信号光得到第一信号光强I1(x,y)，控制第二光路的频率为V2，探测频率为V2的信号光得到第二信号光强I2(x,y)，并计算各扫描点处的有效信号光强I(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标，得到超分辨显微图像。本发明专利技术还公开了一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置。本发明专利技术成像速度快，可以同时扫描被差分图像，而且受激辐射相比原本方法的自发辐射要来的快。

【技术实现步骤摘要】
一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置和方法
本专利技术属于超分辨领域，尤其涉及一种快速的基于pump-probe技术的超分辨显微方法和装置。
技术介绍
由于光学系统衍射的影响，常规远场光学显微方法可实现的分辨率存在限制。根据阿贝衍射极限理论，光束经显微物镜聚焦后所成光斑的尺寸用半高全宽表示为其中λ为显微镜的工作波长，NA为所用显微物镜的数值孔径。因此，常规远场光学显微镜的极限分辨率一般被限制在了半波长左右。泵浦-探针(Pump-probe)技术作为一种标准的非线性测量工具，Pump-probe技术已经存在了几十年，它用于表征激发介质的光致光学变化特性。基本概念就是一个泵浦光脉冲用于激发样品使样品跃迁到高能级，第二个探测光经过可调节时延后探测样品，泵浦导致的光谱透射率的变化，成为泵浦和探测之间的一个时延函数。通过监控探针信号的时延功能，可以获取信息衰变或是在其他流程中的泵浦脉冲产生的激励。这种测量方法的分辨率高，精度好，但缺点在于没能突破衍射极限。近年来，为了突破光学衍射极限的限制，提高显微系统的分辨率，科研工作者们提出了多种超分辨光学显微方法。例如：受激发射损耗显微术(STED：StimulatedEmissionDepletionMicroscopy)，即利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系，并通过限制受激辐射衰减的区域，减少荧光光斑大小，获得小于衍射极限的发光点来提高系统分辨率，从而突破远场光学显微术的衍射极限分辨力限制来实现无接触三维成像；结构光照明荧光显微术(SIM：StructuredIlluminationMicroscopy)；随机光场重建显微术(STORM:StochasticOpticalReconstructionMicroscopy)以及在STED基础上进行改进的荧光辐射差分显微术(FED：FluorescenceEmissonDifferenceMicroscopy)。上述几种方法均可以在远场实现荧光超分辨显微，在实际测试中也得到了相应的应用，但是都还仍然存在着不足。其中，STED显微术的分辨率由所加损耗光的光功率决定，因此当实现高分辨率时，其所要求的光功率很强，容易导致荧光分子的漂白。此外，STED显微术的系统较为复杂，造价一般比较。SIM显微术对光功率的要求虽然不高，但是由于其需要光栅扫描，成像速度较慢，成像系统也较为复杂。STORM显微术的成像速度也很慢，目前还很难运用于活体细胞的实时检测当中。FED显微术虽然比之前有所改进，但需要前后两次扫描成空心和实心像，成像速度相对较慢。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置和方法，可以在远场实现超衍射极限的分辨率。该种方法和装置具有成像速度快、可以同时扫描、成像速度快、分辨率高等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。一种基于泵浦-探针技术的超分辨方法，包括以下步骤：1)将第一激光器发出的第一束激光光束经扫描振镜后投射到待测样品上，使待测样品上的原子向上跃迁至激发能级；2)第二激光器发出激光照射到位相板上，对第二束线偏振光进行相位调制，调制函数为ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；3)将所述相位调制后的线偏振光进行光路偏转；4)偏转后的光束经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上,待测样品上的处于激发态的发光原子在外来辐射场的作用下，向低能态跃迁，辐射光子发光，以实现对待测样品的第一次二维扫描；5)辐射出的光子经过放置在样品台下方的显微镜后进入探测系统，探测器与锁相环和计算机相连，因为第二光路的锁相环接收到特定频率的参考光，经调制后的激光束也会在特定的第二探测器上成像，像返回到计算机。6)在二维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第一信号光强I1(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标；7)由第三激光器发出光，因为没有经过位相板，相当于调制函数为ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；8)对各扫描点进行第二次扫描，收集得到的第二信号光强I2(x,y)；9)根据公式I(x,y)＝I1(x,y)-γI2(x,y)计算有效信号光强I(x,y)，并利用I(x,y)得到超分辨图像，其中，为第一信号光强I1(x,y)中的最大值，第二信号光强I2(x,y)中的最大值。当待测样品为荧光样品时，所述信号光为所述圆偏振光经显微物镜投射后在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品，第一激光器发出光线投射到样品上，使样品上发光原子跃迁到激发态，第二、三束光通过样品后使样品产生受激辐射产生相同的光束，记为第1、2号信号光，所述信号光透过样品后进入样品下的显微物镜，经过二色镜后分别被探测器接收。待测样品上的x，y轴方向由二维扫描方向决定。所述有效信号光强值I(x,y)为负时，设置I(x,y)＝0。本专利技术提供了一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置，包括第一光源、第二光源、第三光源，承载待测样品的样平台和将光线投射到所述样品台的显微物镜以及样品台下的显微物镜及两个探测系统，还包括:位于第一光路上的第一起偏器，沿第二光路依次布置的第二起偏器和位相板，第三光路上的起偏器，对二、三路光束进行偏转的二色镜。用于将所述第一、二、三光路上的光线进行偏转的扫描振镜系统，依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光线进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜，用于将准直后的光束转换为圆偏振光的1/4波片，所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上；并设有控制所述第一、二、三光源和扫描振镜系统的锁相环及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。探测系统包括：用于滤去分束镜出射的信号光中的杂散光的带通滤波片，所述带通滤波片在待测样品为非荧光样品时可以省略；布置在样品之下显微镜后的二色镜，所述分束镜在第二、第三光源发出相同波长激光时应选为分束镜；用于探测信号光束的光强信号的探测器，所述探测器选用光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)；用于将滤光后的信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述聚焦透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾里斑直径。所述第一光源与第一起偏器之间依次设有第一单模光纤和第一准直透镜，所述第二光源和第二起偏器之间依次设有第二单模光纤和第二准直透镜，同理第三光路。所述位相板的调制函数为其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，φ为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。第二激光器连接一个特定的锁相环，用一特定频率信号调制形成空心光斑的光束的激光器，使其发出的第一光束的频率为v，并用此频率信号作为锁相放大器的参考信号。第一、第二和第三光束通过相应的调制函数调制后经过分束棱镜合并成一路光，光轴重合，通过显微物镜照射到样品表面。在被光斑照射的范围内样品所发出的信号光通过分光棱镜分成三束，其中一束由锁相放大器探测。锁相放大器根据参考信号v，从两束信号光中提取其被调制过的第一光束对应的空心斑信号光强I1(x，y)。同理第三激光器和它对应的锁相环、探测器。同时，激光器发出光与探测器接收光的频率应与扫描振镜系统的帧扫描频率相同，从而实现本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于泵浦‑探针技术的超分辨方法，第一光束照射样品并使样品的原子跃迁至激发态，第二光束经相位调制后在样品上形成空心光斑并激发信号光，第三光束在样品上形成实心光斑并激发信号光，其特征在于，控制第三光束的频率为V1，探测频率为V1的信号光得到第一信号光强I1(x,y)，控制第二光路的频率为V2，探测频率为V2的信号光得到第二信号光强I2(x,y)，并计算各扫描点处的有效信号光强I(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标，得到超分辨显微图像。

【技术特征摘要】
1.一种基于泵浦-探针技术的超分辨方法，第一光束照射样品并使样品的原子跃迁至激发态，第二光束经相位调制后在样品上形成空心光斑并激发信号光，第三光束在样品上形成实心光斑并激发信号光，其特征在于，控制第三光束的频率为V1，探测频率为V1的信号光得到第一信号光强I1(x,y)，控制第二光束的频率为V2，探测频率为V2的信号光得到第二信号光强I2(x,y)，并计算各扫描点处的有效信号光强I(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标，得到超分辨显微图像；所述的第二光束对应的相位调制函数为：其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；计算有效信号光强I(x,y)的公式为：I(x,y)＝I1(x,y)-γI2(x,y)其中，为第一信号光强I1(x,y)中的最大值，为第二信号光强I2(x,y)中的最大值。2.如权利要求1所述的基于泵浦-探针技术的超分辨方法，其特征在于，所述的有效信号光强值I(x,y)为负时，设置I(x,y)＝0。3.如权利要求1所述的基于泵浦-探针技术的超分辨方法，其特征在于，所述的第一光束、第二光束和第三光束具有不同的波长。4.一种基于泵浦-探针技术的超分辨装置，包括第一光源、第二光源、第三光源，承载待测样品的样平台，将光线投射到所述样品台的显微物镜，样品台下的显微物镜，两个探测系统，和...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘旭，赵光远，王轶凡，匡翠方，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33