本发明专利技术提供了一种聚乙二醇修饰的rhG‑CSF活性药物组合物。本发明专利技术的聚乙二醇修饰的rhG‑CSF活性组合物药物包括以下组分：组分Ⅰ：N‑末端mono‑mPEG‑rhG‑CSF，95.0%≤纯度＜98.0%；组分Ⅱ：rhG‑CSF、非N‑末端mono‑mPEG‑rhG‑CSF、di‑mPEG‑rhG‑CSF、tri‑mPEG‑rhG‑CSF中的一种或者几种，0%≤含量≤5.0%，且0%≤rhG‑CSF含量≤3.0%；组分Ⅲ：mPEG，0%≤含量≤5.0%；以及其他组分，包含外源性DNA、宿主菌蛋白等，0%≤含量＜0.5%。本发明专利技术提供的聚乙二醇修饰的rhG‑CSF组合物的药物活性，各项指标均符合药用要求，质量稳定，且体外活性、半衰期、安全性等方面均优于现有技术产品，能够保证聚乙二醇修饰的rhG‑CSF制剂的临床疗效及用药安全。
【技术实现步骤摘要】
一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性药物组合物
本专利技术涉及蛋白质修饰及纯化领域，具体而言就是涉及一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性药物组合物。
技术介绍
粒细胞集落刺激因子G-CSF可用于各种细胞减少症，可以使干细胞和前体细胞从骨髓转移，并用于治疗由化学疗法引起的粒细胞减少症患者。蛋白质治疗药物重组人粒细胞刺激因子（rhG-CSF）的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，即其体内半衰期较短，用药后很快从体内清除，需要每天应用，从而增加了患者的痛苦。PEG-rhG-CSF是由rhG-CSF蛋白经PEG（聚乙二醇）修饰所得，其血浆半衰期延长，并且免疫原性降低、生物利用度提高、稳定性增强、安全性更高。中国专利申请CN1139932A（文献1）公开了一种N-末端单聚乙二醇化的rhG-CSF的制品，在该专利说明书中，未提示纯化后样品单PEG化的rhG-CSF的含量。我们参考该专利公开方法，采用mPEG20kDa对rhG-CSF进行反应，单PEG化的rhG-CSF的转化率只有70%左右，同时对其产品进行体外活性检测，其生物学活性为3.5×107IU/mg。中国专利申请CN1663962A（文献2）公开了rhG-CSFN末端和非N末端聚乙二醇修饰物及其一步纯化工艺。我们参考该专利公开的方法，采用mPEG20kDa对rhG-CSF进行反应，经纯化后的产品含98%mPEG-rhG-CSF及2%的rhG-CSF，其生物学活性为4.0×107IU/mg。根据文献1公开的方法制得的mPEG-rhG-CSF其纯度仅有70%左右，含有杂质较多，同时其生物学活性为3.5×107IU/mg，活性较低。根据文献2制得的N末端mPEG-rhG-CSF其纯度可达到98%以上，但是其生物学活性与文献1制得的产品活性相近，仅为4.0×107IU/mg活性较低。
技术实现思路
为了提高N-末端mPEG-rhG-CSF的产品纯度及其生物学活性，获得药效更高的产品而提供一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性药物组合物。本专利技术主要是通过对制备得到的mPEG-rhG-CSF产品进行研究，发现产品中主要存在以下组分：(1)未反应完的原料，如：mPEG，rhG-CSF；(2)其它取代位置的单（mono）取代mPEG-rhG-CSF；(3)多取代的mPEG-rhG-CSF，如di-mPEG-rhG-CSF、tri-mPEG-rhG-CSF；(4)其它组分，如外源性DNA、宿主菌蛋白等。专利技术人通过大量研究发现，当产品中N末端mono-mPEG-rhG-CSF的纯度在[95%，98%）区间，上述(2)~(3)类组分总和含量在[2%，5%）区间，且(1)类组分中rhG-CSF含量在[0，≤3%]区间，(4)类组分含量在（0，0.5%）区间时，产品质量稳定，保障了其临床用药安全。因此，本专利技术提供一种N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物活性组合物，包括以下组分：组分Ⅰ：N-末端mono-mPEG-rhG-CSF，95.0%≤纯度＜98.0%；组分Ⅱ：选自rhG-CSF、非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri-mPEG-rhG-CSF中的一种或几种，0≤含量≤5.0%，且0≤rhG-CSF含量≤3.0%；组分Ⅲ：mPEG，0≤含量≤5.0%；以及其他组分，0≤含量＜0.5%。上述药物活性组合物中：优选地，组分I：96.0%≤纯度＜97.0%；组分II：选自rhG-CSF、非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri-mPEG-rhG-CSF中的一种或几种，0≤含量≤3.0%；组分III：0≤mPEG含量≤3.0%；以及其他组分，0≤含量＜0.5%；更优选地，组分I：97.0%≤纯度＜98.0%；组分II：选自rhG-CSF、非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF、di-mPEG-rhG-CSF、tri-mPEG-rhG-CSF中的一种或几种，0≤含量≤2.0%；组分III：0≤mPEG含量≤2.0%；以及其他组分，0≤含量＜0.5%。上述任一药物活性组合物中，所述组分II与组分III的总含量≥2%。上述任一药物活性组合物中，所述mPEG优选为分子量为20kDa的mPEG。上述任一药物活性组合物中，所述其他组分包含外源性DNA、宿主菌蛋白；优选地，所述外源性DNA含量≤10ng/剂量，所述宿主菌蛋白含量≤0.02%。rhG-CSF序列中的5个赖氨酸为mPEG的结合位点，因此，上述药物活性组合物中，所述mono-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中，任一位点与PEG结合的mPEG-rhG-CSF；非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF指的是，除N-末端外，其它任一结合位点形成的mono-mPEG-rhG-CSF；所述di-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中任意两个位点结合mPEG的mPEG-rhG-CSF；所述tri-mPEG-rhG-CSF指的是，5个结合位点中任意三个位点结合mPEG的mPEG-rhG-CSF。本专利技术中所述组分Ⅰ含量指的是其蛋白含量。本专利技术的N-末端mono-mPEG-rhG-CSF药物组合物制成的mPEG-rhG-CSF产品，体外活性≥9.0×107IU/mg。本专利技术所述聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性组合物，其纯度可达到95%以上，且其生物学活性达到9.0×107IU/mg以上，是现有技术制备产品的生物学活性的两倍以上，因此本专利技术的药物组合物具有更优的药效。同时，本专利技术的药物组合物的其他各项指标均符合药用要求，质量稳定，且半衰期、安全性等方面均优于现有技术产品，能够保证N-末端mono-mPEG-rhG-CSF制剂的临床疗效及用药安全。具体实施实例实施例1制备mPEG-rhG-CSF粗品制备rhG-CSF反应溶液，浓度为5.0mg/mL，含有100mMNaH2PO4，20mMNaCNBH3，pH5.0，将其于4℃下充分搅拌后，加入摩尔数为rhG-CSF摩尔数5倍量的20kDamPEG，反应液于4℃下搅拌反应10h。然后将反应液用100mMHCl调至pH4.0，浓缩，得mPEG-rhG-CSF粗品。HPLC检测，检测结果见表3，体外活性测定结果见表4。实施例2：N-末端mono-mPEG-rhG-CSF的制备（1）离子交换色谱法层析：将实施例1所得mPEG-rhG-CSF粗品用MacroCapSP（直径300mm，高12cm）的离子交换色谱法层析：①上样：将mPEG-rhG-CSF粗品以缓冲液A（10mM醋酸钠-醋酸，0.004%吐温-80，pH4.0±0.5）稀释至100~200μg/mL，以340mL/min±10%流速上样，上样量10mg蛋白/ml填料；②冲洗：以缓冲液A400mL/min±10%流速冲洗3个柱体积；③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B（1M氯化钠，10mM醋酸钠-醋酸，0.004%吐温-80，pH4.0±0.5）以90mL/min±10%的流速洗脱梯度洗脱6个柱体积（梯度从0%至60%），收集mPEG-rhG-CSF蛋白洗脱峰；（2）分子筛层析：①将离子交换层析收集的mPEG-rhG-CSF蛋白用S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种聚乙二醇修饰的rhG‑CSF活性药物组合物，其特征在于，包括以下组分：组分Ⅰ：N‑末端mono‑mPEG‑rhG‑CSF，95.0%≤纯度<98.0%；组分Ⅱ：选自rhG‑CSF、非N‑末端mono‑mPEG‑rhG‑CSF、di‑mPEG‑rhG‑CSF、tri‑ mPEG‑rhG‑CSF中的一种或几种，0≤含量≤5.0%；组分Ⅲ：mPEG，0≤含量≤5.0%；以及其他组分，包含外源性DNA、宿主菌蛋白，0≤含量<0.5%。
【技术特征摘要】
1.一种聚乙二醇修饰的rhG-CSF活性药物组合物，其特征在于，包括以下组分：组分Ⅰ：N-末端mono-mPEG-rhG-CSF，纯度=97.8%；组分Ⅱ：rhG-CSF和di-mPEG-rhG-CSF，di-mPEG-rhG...
【专利技术属性】
技术研发人员：窦燕峰，
申请(专利权)人：石药集团百克山东生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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