本发明专利技术公开了一种末端连接脯氨酸的聚乙二醇的酸或活性酯的制法和应用，该发明专利技术应用于医药领域。此聚合物活性酯在水中水解半衰期为10.9分钟，具有理想的与生物活性物质的氨基反应的活性。其结构式如下：R1－(OCH2CH2)n－O－R2其中n＝43~680；R1可以是CH3－，也可以是R2R2的结构如下：R3可以是H－，也可以是－N－丁二酰亚胺基。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及聚乙二醇水溶性聚合物及其制备方法和应用，尤其涉及聚乙二醇活性酯及其制备方法和应用。
技术介绍
使用化学方法将水溶性聚合物聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）结合到分子和表面在生物技术中具有重大的应用意义。PEG在生物
有着广泛的应用：一些PEG的活性衍生物结合到蛋白质、酶的分子上，即对酶进行修饰，由于PEG可以溶于有机溶剂，PEG结合到酶分子可以使PEG与酶的结合物溶于有机溶剂；与未修饰的蛋白质相比，将PEG连接到蛋白质上可减小蛋白的免疫原性、降低肾脏排除速率，并可从中促使结合物在血液循环中的半衰期的增加；PEG结合到表面可减小蛋白质和细胞的吸附并改变表面的带电性质，PEG结合到脂质体上可以使其半衰期有极大增加，并能够增加其作为药物缓释的介质的能力。PEG只有经过活化才能够结合到分子或表面上。因此，一系列的活化衍生物被制备出来。目前应用较广的修饰剂活化类型为羧酸的活化酯类。该类修饰剂是通过活化酯对蛋白的自由氨基进行酰化，从而将PEG链结合到蛋白质分子上实现修饰的。目前，许多用于修饰的活化的羧基PEG具有较差的反应活性。例如，羧甲基化PEG（CM-PEG）的NHS酯的反应活性太强，以至溶解在水中立刻水解（在pH8、25°C下的水解半衰期为0.75 min），这种高反应活性是羧甲基化PEG活性酯的严重缺陷。而第一代修饰剂中活化的SC-PEG虽然有较好的反应活性（在pH8、25°C下的半衰期为20.4 min），但由于在分子内含有不稳定的酯键，现已较少使用。又如丁二酸酐丁二酰亚胺酯活化的PEG（succinimidyl succinate，SS-PEG）。SS-PEG的制备是通过mPEG与丁二酸酐发生酯化反应，使丁二酸酐开环，从而在PEG的链端造成一个羧基，然后又将羧基活化成丁二酰亚胺酯。该试剂在与蛋白质结合后还存在一个酯键，而酯键由于其固有的不稳定性在PEG高分子结合到蛋白质上时非常容易被水解。这种水解不仅会使PEG链从蛋白上脱落，丧失PEG修饰带来的益处，而且留在蛋白质上的丁二酸尾部还可作为半抗原导致蛋白质的免疫原性。Harris等人在mPEG的末端引入丙酸单位，使得这种丙酸PEG活性酯的水解半衰期增加到16.5分钟，但该方法涉及了在PEG一端引入氰基，需要再进行强酸和强碱的水解才能得到产物，极有可能破坏PEG主链。目前，许多用于修饰的活化的羧基PEG具有很差的反应活性：不是反应太快就是反应太慢。例如，羧甲基化PEG（CM-PEG）的NHS酯的反应活性太强，以至溶解在水中立刻水解，这种高反应活性是羧甲基化PEG活性酯的严重缺陷。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是公开一种末端连接脯氨酸的聚乙二醇的酸或活性酯的制法和应用，以克服现有技术存在的缺陷，满足医药领域和生物工程领域发展的需要。本专利技术的末端连接脯氨酸的聚乙二醇的活性酸或酯的结构式如下：R1－(OCH2CH2)n－O－R2其中n＝43~680；R1可以是CH3－，也可以是R2R2的结构如下：R3可以是H－，也可以是－N－丁二酰亚胺基。本专利技术提供的连接脯氨酸的聚乙二醇的活性酯具有合适的反应活性，活性酯在水中的水解半衰期为10.9分钟，且不含有其它的酯键连接。本专利技术的连接脯氨酸的聚乙二醇的活性酯的制备方法包括如下步骤：（1）CM-PEG（羧甲基化聚乙二醇）的制备：将聚乙二醇溶于甲苯中，加入叔丁醇钾回流反应1~2小时，加入溴乙酸乙酯回流反应2~4小时，然后室温反应18~24小时，浓缩后用乙醚沉淀，沉淀物碱水解然后酸化，采用常规的方法收集产物；（2）脯氨酸乙酯盐酸盐的制备：将氯化氢气体通入含有脯氨酸的乙醇直到饱和，然后收集脯氨酸乙酯盐酸盐；（3）末端连接脯氨酸的聚乙二醇酸衍生物的制备：取步骤（1）中制备的CM-PEG溶于二氯甲烷，然后依次加入二环己基碳二亚胺、脯氨酸乙酯盐酸盐，然后用三乙胺将溶液的pH值调节到8~9，反应8~12小时，过滤，滤液加入乙醚，收集沉淀产物，将产物干燥后溶于水，加入氢氧化钠溶液调节pH至10~12，反应1~3小时，然后用草酸将溶液pH调节到2~4，收集产物，获得末端连接脯氨酸的聚乙二醇酸衍生物。（4）取步骤（3）的产物溶于二氯甲烷，加入1.5~3倍摩尔量的二环己基碳二亚胺和1.5~3倍摩尔量的N-羟基丁二酰亚胺，10~30℃搅拌反应20~28小时，收集产物，获得末端连接脯氨酸的聚乙二醇活性酯。所说的脯氨酸为D型、L型或外消旋体；聚乙二醇优选的分子量为2000~30000 Da。本专利技术的末端连接脯氨酸的聚乙二醇的活性酯，在水中拥有10.9分钟的水解半衰期，具有理想的与生物活性物质氨基的反应活性，可用于与生物活性物质相连接，制备PEG修饰的生物活性物质，用于制备缓释药物的介质等。本专利技术还涉及一种所说的末端连接脯氨酸的聚乙二醇活性酸或酯与生物活性物质的结合物，结构通式如下：其中：n为1或2，NH-Pro部分代表生物活性物质的氨基位点。生物活性物质选自蛋白质、酶、多肽、药物、染料、核苷、酯类或脂质体。采用上述方法制备的末端连接脯氨酸的聚乙二醇活性酯，具有良好的反应活性，可用于与蛋白质或酶的分子相连接，以及用于制备缓释药物的介质。具体实施方式实施例1与分子量为5000 Da的单甲氧基PEG以酰胺键连接的脯氨酸活性酯的合成步骤1：CM-PEG（羧甲基化聚乙二醇）的制备：将分子量为5000 Da的单甲氧基聚乙二醇15 g（3 mmol）溶于甲苯中，蒸馏出一部分甲苯以共沸除水，然后加入4 mmol的叔丁醇钾回流反应1.5小时，而后缓慢加入4 mmol的溴乙酸乙酯回流反应3小时，然后室温反应21小时，过滤除去沉淀后减压蒸去溶剂，残留物加少量二氯甲烷溶解，用干燥乙醚沉淀出产物，将该产物溶于去离子水中，加入0.1 mol/L的氢氧化钠溶液直到溶液的pH值稳定在pH10，然后用0.1 mol/L的盐酸调节溶液的pH到3，用等量的氯仿萃取溶液三次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，浓缩后用乙醚沉淀干燥得到分子量为5000 Da的CM-PEG，分子式如下：CH3O-(CH2CH2O)n-CH2COOH。步骤2：脯氨酸乙酯盐酸盐的制备：将20 g 脯氨酸加入到300 mL无水乙醇中，在搅拌下通入干燥的氯化氢气体直到饱和，然后加入无水乙醇进行减压蒸馏，将多余的氯化氢除去，接着将溶液浓缩至合适的体积，用干燥无水的乙醚沉淀得到脯氨酸乙酯盐酸盐。步骤3：合成以酰胺键连接的mPEG－脯氨酸缀合物：取7.5 g（1.5 mmol）步骤（1）中制备的CM-PEG溶于40 mL干燥的二氯甲烷中，然后依次加入2 mmol的二环己基碳二亚胺、2 mmol的脯氨酸乙酯盐酸盐，然后用三乙胺将溶液的pH值调节到8，搅拌反应12小时，过滤除去沉淀后，加入无水乙醚沉淀产物，将产物干燥后溶于去离子水，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种末端连接脯氨酸的聚乙二醇的酸或活性酯，其特征在于，结构如下：R1－(OCH2CH2)n－O－R2其中n＝43~680；R1可以是CH3－，也可以是R2R2的结构如下：R3可以是H－，也可以是－N－丁二酰亚胺基。688251dest_path_image001.jpg
【技术特征摘要】
1.一种末端连接脯氨酸的聚乙二醇的酸或活性酯，其特征在于，结构如下：
R1－(OCH2CH2)n－O－R2其中n＝43~680；
R1可以是CH3－，也可以是R2R2的结构如下：
R3可以是H－，也可以是－N－丁二酰亚胺基。
2.根据权利要求1所述的末端连接脯氨酸的聚乙二醇的活性酸或酯，其特征在于，所说的酸或酯为：
此处NHS代表N-羟基丁二酰亚胺。
3.根据权利要求1或2所述的末端连接脯氨酸的聚乙二醇的活性酸或酯的制备方法包括如下步骤：
（1）将聚乙二醇溶于甲苯中，加入叔丁醇钾回流反应1~2小时，加入溴乙酸乙酯回流反应2~4小时，然后室温反应18~24小时，浓缩后用乙醚沉淀，沉淀物碱水解然后酸化，获得CM-PEG；
（2）将氯化氢气体通入含有脯氨酸的乙醇直到饱和，然后收集脯氨酸乙酯盐酸盐；
（3）取步骤（1）中制备的CM-PEG溶于二氯甲烷，然后依次加入二环己基碳二亚胺、脯氨酸乙酯盐酸盐，然后用三乙胺将溶液的pH值调节到8~9，反应8~12小时，过滤，滤液加入乙醚，收集沉淀产物，将产物干燥后溶于水，加入氢氧化钠溶液调节pH至10~12，反应...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊玉春，李志成，罗宇，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：
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