本发明专利技术公开了一种罗汉果糖基转移酶基因UGT74AC1及所述基因UGT74AC1编码的糖基转移酶在合成罗汉果甜甙ⅠE中的应用。糖基转移酶基因UGT74AC1具有SEQIDNO.1所示的核苷酸编码序列及SEQIDNO.2所示的多肽序列。利用本发明专利技术的罗汉果糖基转移酶基因UGT74AC1在大肠杆菌中表达，重组的糖基转移酶UGT74AC1能催化罗汉果醇(Mogrol)与UDP-葡萄糖进行反应生成罗汉果甜甙ⅠE(MogrosideⅠE)。本发明专利技术的糖基转移酶基因UGT74AC1可应用于人工合成罗汉果甜甙ⅠE。同时，该基因在转基因技术改造罗汉果以提高罗汉果甜甙含量方面具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
罗汉果糖基转移酶基因 UGT74AC1及其应用
本专利技术涉及生物
，更具体地是涉及一种新的糖基转移酶及其 在催化罗汉果醇生成罗汉果甜甙I E中的应用。
技术介绍
罗汉果为葫芦科藤本落叶植物罗汉果（Siraiiia griosreflorii Swingle)的成 熟果实，是我国所特有的珍贵药用和甜料植物，1977年以来一直收录于中华人民共和国 药典，作为常用中药使用。卫生部和中医药管理局将罗汉果列入第一批既是药品又是 食品的品种名单。罗汉果味极甜、性凉、无毒，具有止咳润肺、化痰补血、润肠通便、祛瘀 等功會泛（Prakash, Indra, and Venkata Sai Prakash Chaturvedula. Additional New Minor Cucurbitane Glycosides from Siraitia grosvenorii. Molecules 19.3 (2014): 3669-3680.)〇 罗汉果甜甙是罗汉果中的主要活性物质，是一种高甜度、低卡路里的理想 天然甜味剂，此外还具有降血糖、抗氧化、抗癌、抗病毒等作用（Chiu, Chun-Hui, et al. Biotransformation of Mogrosides from Siraitia grosvenorii Swingle by Saccharomyces cerevisiae. Journal of agricultural and food chemistry 61. 29 (2013) : 7127-7134.)。罗汉果甜甙是葫芦烷型四环三萜类化合物，自上世纪70年代以来， 国内外学者对其进行了大量研究，并先后从罗汉果中分离获得了罗汉果甜甙I E、IIEJII 、I￥、V、VI和赛门甙等20多种甜甙。这类物质除少数外，均为极甜或微甜成分，其中罗汉 果甜甙V是罗汉果中含量最高的成分，其甜度在水中浓度为万分之一时，是5%蔗糖水溶液 的 425 倍（Kasai R， Nie R Lj Nashi K， et al. Sweet Cucurbitane Glycosides from Fruits of Siraitia siamensis (chi-zi luo-han-guo)， a Chinese Folk Medicine (Organic Chemistry) [J]. Agricultural and biological chemistry, 1989，53(12): 3347-3349.)。罗汉果甜甙化学结构复杂，目前还不能化学合成，只能从罗汉果中提取获得。 同时，由于罗汉果对生长环境要求苛刻，仅限于广西北部等少数地区生成，且果实生长周期 长，甜甙含量低，果实产量受自然环境影响大，无法满足市场需求，因此亟待探索提高罗汉 果甜甙的新方法。 糖基转移酶（Glycosyltransferase)是生物体内广泛存在的一大类酶，它将 活性的糖供体如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖等转移到糖受体如三萜类、黄酮类、苯丙酯 类等化合物的 _C00H、-0H、-NH2等基团上形成糖苷（Das，Shibendu Sekhar，et al. Purification and characterization of a betanidin glucosyItransferase from Amaranthus tricolor L catalyzing non-specific biotransformation of flavonoids. Plant Science 211 (2013): 61-69.)。糖基化是生物体内常见的具有重要意义的生化 反应之一，通过糖基化改变糖受体的稳定性、水溶性、生物活性以及在细胞内的运输及定 位，另外，通过糖基化还能降低或者去除内源及外源性物质的毒性（Richman，Alex，et al. Functional genomics uncovers three glucosyItransferases involved in the synthesis of the major sweet glucosides of Stevia rebaudiana. The Plant Journal 41. I (2005): 56-67.)。罗汉果甜甙共同的前体物质是罗汉果醇，其3号碳和24号碳上连 接的羟基分别可以被糖基化并通过β-1 - 6糖苷键生成相应的罗汉果甜甙I E和罗汉果甜 甙I A，或3号碳和24号碳上连接的羟基同时被糖基化生成罗汉果甜甙II E。此外，罗汉果 醇3号碳和24号碳羟基上连接的葡萄糖分子的2号位羟基和6号位羟基又都可继续被糖 基化，从而生成最多含有6个葡萄糖基的罗汉果甜试VI。糖基化修饰是罗汉果甜甙生物合 成途径中最后一步反应，糖基化的程度决定了罗汉果甜甙的品质。目前罗汉果甜甙糖基化 修饰机理目前还是一片空白，发现并明确罗汉果甜甙糖基化修饰过程中关键糖基转移酶对 罗汉果育种及通过代谢工程技术生成罗汉果甜甙具有重要的意义。 是罗汉果糖基转移酶家族中的一员，在之前的转录组研究中发现了包 括在内的可能参与罗汉果甜甙合成途径中的的大量糖基转移酶编码基因（Tang， Qij et al. An efficient approach to finding Siraitia grosvenorii triterpene biosynthetic genes by RNA-seq and digital gene expression analysis. BMC genomics 12. I (2011): 343.)，但是并不明确这些糖基转移酶是否真的与罗汉果甜甙的 合成有关。现有的文献检索表明，国内外尚未有任何有关糖基转移酶在催化甜甙 合成的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供从罗汉果转录组数据库中挖掘到的糖基转移酶基因 如77办G其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1，所编码的多肽序列如SEQ ID NO:2。具体是以 罗汉果果肉为原料，经液氮碾磨后，利用Trizol试剂提取罗汉果总RNA，然后以提取的RNA 为模板逆转录获得罗汉果的总cDNA。获得总cDNA后，再利用特定的引物通过PCR扩增获得 糖基转移酶编码基因。 本专利技术的目的之二是提供一种糖基转移酶的表达与纯化方法。具体是 将获得的糖基转移酶WMIV通过和feoRI双酶切与同样经和feoRI双酶切 处理的大肠杆菌表达质粒进行连接，重组质粒经测序验证正确后，再转化导入到大肠杆菌 Rosetta garni (DE3)中，构建重组大肠杆菌。挑取重组大肠杆菌单菌落接种至5 mL LB培 养基中，在37°C、200rmp条件下，培养过夜。按照1%的接种量，将种子液接种于100 mL培 养基中，在37°C、200rmp条件下，培养2-3 h。当菌体浓度0D600达到0. 6-0. 8时，添加终浓 度为0. I mmol的IPTG，同时降低培养温度至16°C，摇床转速降低至150 rmp，诱导时间为 20h。然后通过离心收集菌体，经超声破碎本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列来自下组：具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列不同但是编码SEQ ID NO.2所示的多肽序列的核苷酸序列；与序列SEQ ID NO.1所示序列同源性≧85%（较佳地95%），且具有催化罗汉果醇生产甜甙ⅠE活性的核苷酸序列；在高严谨条件下可以与序列表SEQ ID NO.1限定的序列杂交的核苷酸序列与任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1. 一种核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列来自下组： 具有如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列； 与SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列不同但是编码SEQIDNO. 2所示的多肽序列的 核苷酸序列； 汉：与序列SEQIDNO. 1所示序列同源性3 85% (较佳地95%)，且具有催化罗汉果醇生 产甜甙IE活性的核苷酸序列； :X:在高严谨条件下可以与序列表SEQIDNO. 1限定的序列杂交的核苷酸序列 ?与[￡: 0!]⑶任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。2. -种多肽序列，其特征在于所述多肽序列选自下组： LC具有如SEQIDNO. 2所示的多肽序列； [2;SEQIDNO. 2所示的多肽序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸且具有 催化罗汉果醇生成甜甙IE活性的由a>衍生的多肽序列； ?多肽序列与SEQIDNO. 2所示多肽序列的同源性3 90% (较佳地95%)，并且具有催 化罗汉果醇生成甜甙IE活性的由工衍生的多肽序列。3. -种重...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙媛霞，戴隆海，张江生，门燕，朱玥明，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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