耐高温酿酒酵母及其应用制造技术

耐高温酿酒酵母及其应用，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年7月3日，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M2014312。本发明专利技术应用离子注入结合高温驯化技术诱变筛选得到的耐高温酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）NT102002耐高温40℃，可用于木质纤维素原料同步糖化发酵制备燃料乙醇，为提高酿酒酵母的温度耐受性提供了新的可行的技术选择；此技术相对于传统的诱变育种技术方法简单，突变率高，所得到的突变株性状稳定。

【技术实现步骤摘要】
耐高温酿酒酵母及其应用
本专利技术涉及微生物
，具体涉及耐高温酿酒酵母及其应用。
技术介绍
近年来，将甘蔗、木薯和纤维素类农林废弃物等转化为燃料乙醇已成为解决世界能源危机的一条理想途径，尤其是利用纤维素类废弃物转化生产燃料乙醇得到世界各国政府的支持及广大科研工作者的普遍关注。在发酵制备纤维素燃料乙醇的过程中，通过糖酵解途径，酵母菌将葡萄糖转化为乙醇和二氧化碳，乙醇转化率可以达到90、5%。然而此路线存在的重要问题之一是:纤维素酶的最适温度为45?50°C之间，而酵母的最适发酵温度一般在28?35°C之间，这使得酵母的发酵与纤维素的酶解难以同步进行，因此提高乙醇酵母的最适发酵温度就成为解决这一问题的关键。 酵母菌的耐热机制复杂，关系到细胞内多个生理过程的改变以及细胞内部结构的稳定，其中热休克蛋白、海藻糖、应激糖蛋白大分子等是与菌体耐热性关系最为紧密的基因。目前提酿酒酵母耐热性的实验技术包括高温驯化、自然选育、诱变育种、原生质体融合育种及基因组改组技术。专利CN 102492634 A从土壤中筛选得到一株耐高温酵母Ogataeasp.WXT3，能在25?48°C温度下发酵生产乙醇；专利CN 102041235 A从米酒酒曲中筛选得到一株耐高温酵母Saccharomyces cerevisiae FE-B,该菌株可以耐受36?44°C的高温；专利CN103232948 A通过对酿酒酵母进行紫外诱变及基因重排，选育得到 Saccharomyces cerevisiae SY-5-11L,在 38°C条件下乙醇产量为 13.9% (V/V);专利CN 102154138 A利用基因改组技术筛选得到耐高温、耐酒精、耐酸的高产乙醇酵母突变株TT31，在35°C条件下，以蔗糖为碳源乙醇产量达到101.9g/L。 由于酵母菌耐热机制尚未明确，相关基因与耐热性的关系还需深入研究，应用基因工程技术提高酵母菌的温度耐受性还有诸多限制。离子注入技术作为一种新型诱变源，以其特殊的物理化学复合诱变效果，已成功应用于许多农作物品种改良和微生物菌种的诱变选育中，并取得了可观的经济效益。研究表明，离子束诱变起因不仅是由于能量沉积引起的DNA单双链断裂，并且还通过离子注入过程中质、能、电多因子作用使遗传物质分子、原子发生移位和重组，且其突变性状具有多发性和重复性的特点，因此离子注入相当于一种复合诱变，比单一诱变更有效；此外在诱变过程中可以通过不同参数组合(离子种类、能量、注量、电荷数等)注入达到有益突变的调控最终获得符合选育目标的突变菌株。但目前尚未发现应用离子注入技术改变生物温度耐受性的报道。
技术实现思路
解决的技术问题:本专利技术的目是提供一株耐高温酿酒酵母及其在木质纤维素类原料同步糖化发酵燃料乙醇中的应用。 技术方案:耐高温酿酒酵母cererisiae) NT102002,该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年7月3日，保藏单位名称:中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏编号=CCTCC N0:M2014312o 所述耐高温酿酒酵母cerevisiae') NT102002在木质纤维素类原料同步糖化发酵燃料乙醇中的应用。 所述发酵用培养基为PDA培养基。 所述发酵条件ρΗ5.5-6.0、发酵温度范围35_40°C及摇床转速150r/min。 一种用于木质纤维素类原料同步糖化发酵燃料乙醇的组合物，有效成分为耐高温酿酒酵母(SaccAaro焊Ce1S cerevisiae^) NT102002。 有益效果:本专利技术应用离子注入结合高温驯化技术诱变筛选得到的耐高温酿酒酵^iSaccharomyces cerevisiae) NT102002耐高温40°C,可用于木质纤维素原料同步糖化发酵制备燃料乙醇，为提高酿酒酵母的温度耐受性提供了新的可行的技术选择；此技术相对于传统的诱变育种技术方法简单，突变率高，所得到的突变株性状稳定。 【附图说明】 图1为酿酒酵母存活率曲线图；图2为酿酒酵母突变率图； 图3为35°C NT102001发酵曲线图； 图4为40°C NT102002发酵曲线图；图5为以麸皮和秸杆粉为原料发酵曲线图；图6为乙醇标准曲线图。 【具体实施方式】 以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本专利技术的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 实施例1耐高温酿酒酵母诱变条件的确定本专利技术所使用的酿酒酵母来源于安琪酵母股份有限公司。 挑取酿酒酵母单菌落涂布于PDA斜面培养基，在最适温度30°C条件下培养至3-4天；挑取一环酿酒酵母接入PDA液体培养基中，30°C，120转/分钟的条件下培养24小时。 取0.1mL培养液均匀涂布于无菌空培养皿上，以无菌风吹至干燥后进行N+注入。所采用的离子注入机为LZD900型多功能离子注入机，靶室真空度为10_3Pa，以5s脉冲式注入，间隔 15s，注入能量为 1keV,注量分别为 50X 114 N+/cm2U00X 114 NVcm2U50X 114N+/cm2,200 X 114 N+/cm2、250 X 114 N+/cm2 和 300 X 1014N+/cm2。N+注入后，取出平皿，用 0.5mL无菌水洗脱，涂布到PDA固体培养基上，置于初筛温度为33°C的培养箱中培养至长出单菌落，计数单菌落数目。根据单菌落数目统计菌株存活率，存活率曲线见图1，然后继续培养至成熟以备筛选。 挑取生长成熟的单菌落接于PDA斜面培养基，置于复筛温度为32°C的培养箱中继续培养，计数各注量下能够继续生长繁殖的菌株数量，计算各个注量的突变率，以正突变率最高的注量为最佳注量。本实施例中在注入能量为1keV的条件下，最佳离子注量为200X 114 N+/cm2，正突变率达到30% (见图2)。以下实施例均以该注量进行注入诱变。 诱变筛选耐35°C的酿酒酵母本专利技术所使用的酿酒酵母来源于安琪酵母股份有限公司。 挑取酿酒酵母单菌落涂布于PDA斜面培养基，在最适温度30°C条件下培养至3-4天；挑取一环酿酒酵母接入PDA液体培养基中，30°C，120转/分钟的条件下培养24小时。 取0.1mL培养液均匀涂布于无菌空培养皿上，以无菌风吹至干燥后进行N+注入。N+注入后，取出平皿，用0.5mL无菌水洗脱，涂布到PDA固体培养基上，置于温度为33°C的培养箱中培养至长出单菌落，挑取生长成熟的单菌落接于PDA斜面培养基，置于温度为35°C的培养箱中继续培养。在此条件下能够生长的菌株即为耐35°C的酿酒酵母，命名为酿酒酵母 QSaccharomyces cerevisiae、NT102001。 取20g粗制纤维素、600U/g纤维素酶和1mL酿酒酵^iSaccharomycescerevisiae) miQ2QQl培养液装入250 mL摇瓶中，以0.05 mo I/L的柠檬酸钠缓冲液调节发酵液的起始pH值至5.5-6.0，加入蒸馏水定容到10mL,以15本文档来自技高网...

【技术保护点】
耐高温酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）NT102002，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年7月3日，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M2014312。

【技术特征摘要】
1.耐高温酿酒酵母iSaccharomycescerevisiae)K[\Q2QQ2,该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年7月3日，保藏单位名称:中国典型培养物保藏中心，保藏编号=CCTCC N0:M2014312o2.权利要求1所述耐高温酿酒酵母(在木质纤维素类原料同步糖化发酵燃料乙醇中的应用。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：张宁，蒋剑春，卫民，杨静，赵剑，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林产化学工业研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32