一种用HPLC分离测定利奥西呱原料药的有关物质的方法技术

本发明专利技术提供一种采用HPLC分离测定利奥西呱原料药有关物质的方法，所述方法采用十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱柱，再用阴离子对试剂溶液作为缓冲液进行洗脱，并以紫外检测器对利奥西呱原料药中的有关物质进行检测。本发明专利技术所述分析方法具有专属性好，灵敏度高，准确度好，有较好的稳定性指示能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药化工领域，更具体地，涉及一种采用高效液相色谱法分离测定利奥西呱原料药的有关物质的方法。
技术介绍
利奥西呱，化学名为N-[4,6-二氨基-2-[1-[(2-氟苯基)甲基]-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基]-N-甲基氨基甲酸甲酯(简称为RCGT)，其结构式如下：CAS：625115-55-1      分子量：422.42是由德国拜耳制药公司研发的能够激发可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的化合物，sGC通过作用于cGMP而调节多重血管床的血管舒张作用，可用于治疗心血管病证或/和性功能障碍。目前，拜耳制药公司研制的用于治疗肺动脉高压(PAH)的口服片剂已经获得FDA批准，商品名为Adempas。在中国专利CN 1330649C中公开了利奥西呱、其异构体和水合物的三种制备方法，其中一种制备方法中涉及到2-[1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺(以下简称为RCGT 02，专利文献中已经公开了此化合物的制备方法)和4,6-二氨基-2-[1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸甲酯(以下简称为RCGT 03，专利文献中已经公开了此化合物的制备方法)等多个中间体。另外，利奥西呱原料药中还可能含有其异构体(以下简称为RCGT 3-F，可以参照专利文献中利奥西呱的制备方法获得)。以上所述的三个化合物为利奥西呱原料中较为常见的工艺杂质，具体结构式如下：RCGT 02  RCGT 03RCGT 3-F  因此，为了控制利奥西呱原料药的质量，需要控制以上所述的三个工艺杂质以及其他杂质。在目前现有技术中，中国专利CN 1330649C公开了一种用于检测利奥西呱化合物及其中间体纯度的方法。其中所述方法特征是采用带有DAD检测器的HP100高效液相色谱仪；色谱柱是Kromasil RP-18,60mm×2mm，3.5μm；洗脱剂：A相是0.5％HClO4水溶液，B相是乙腈；梯度程序：0min，2％的B相，0.5min，2％的B相，4.5min，90％的B相，6.5min，90％的B相；流速是0.75ml/min；柱温是30℃；检测波长是UV 210nm。所述方法适合于利奥西呱合成反应时监控反应产物纯度，并不适用于对利奥西呱原料的质量监控，特别是对其原料药的有关物质项目进行检测。另外，以0.5％HClO4水溶液作为流动相也不太安全，其高氧化性、腐蚀性可能会对检测样品的稳定性照成影响；对分析检测仪器进行腐蚀，缩短分析仪器的寿命。在现有的技术中，没有公开适合于分析检测利奥西呱原料药有关物质的分析方法。本专利技术提供一种适合于分离检测利奥西呱原料药有关物质的分析方法。
技术实现思路
专利技术概述由于利奥西呱化合物及其有关物质的结构式的特点，含有多氨基的化合物，在反相色谱中一般都会有比较好的亲水性，根据相似相溶的原理，其在水相流动相中的溶解度比较大，而在色谱柱固定相(有机相)中的溶解度较小，因此在反相色谱中出峰会比较快，而且利奥西呱及其有关物质的分离度将不会很理想。又因为利奥西呱及其有关物质多氨基的特点，其很容易和色谱柱上的硅羟基作用，而导致拖尾、峰型的对称性不好、柱效差等问题，在分析定量检测过程中精密度和准确度都会比较差。本专利技术人在通过多次实验，在高效液相色谱仪中采用反相色谱柱，如以十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱柱，再用阴离子对试剂溶液作为缓冲液进行洗脱。由于阴离子对试剂可以和氨基基团进行结合，可以有效的阻挡了氨基基团和硅羟基作用，从而获得优秀的柱效；另外由于离子对试剂和氨基基团相结合，可以增加利奥西呱及其有关物质的亲油性，加强其在反相色谱柱的固定相上的保留，提高利奥西呱及其有关物质的分离度。本专利技术人提供的采用高效液相色谱法分离检测利奥西呱原料药的有关物质的方法能够有效的分离利奥西呱及其有关物质，准确定量各主要杂质的含量。所述分析方法具有专属性好，灵敏度高，准确度好，有较好的稳定性指示能力。本专利技术旨在提供一种采用HPLC分离检测利奥西呱原料药的有关物质的方法。术语定义术语“约”在本专利技术中是指在所述数值的±10％以内。术语“w/v”在本专利技术中是指每100ml溶剂中含有溶质的克数。专利技术详述本专利技术提供的一种采用HPLC分离检测利奥西呱原料药的有关物质的方法，其特征是在高效液相色谱系统中，采用反相色谱柱(如以十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱柱)；流动相由作为A相的阴离子对试剂水溶液或其与有机溶液的混合液和作为B相的有机溶液组成，进行洗脱；采用紫外检测器对利奥西呱原料药的有关物质进行检测。其中，本专利技术所述的方法是采用梯度洗脱的方法进行。梯度洗脱至少包含两个阶段梯度变化，其中第一阶段梯度变换是在0～60min的时间内，A相在流动相中的含量是66％～80％，体积比；第二阶段梯度变化是第一阶段梯度变化的时间基础上在接下来的10～60min的时间内进行，A相在流动相中的含量由66％～80％变化至31.5％～38.5％，体积比。更进一步地，还可以包括第三阶段的梯度变换，所述梯度变化是在第二阶段梯度变化完成后接下来的1～10min内将流动相中A相的含量变化为第一阶段时A相的初始含量，并保持运行5～20min。该阶段可以省去梯度洗脱后的再平衡步骤，并把过度的时间应用到分析检测的时间内，有效地缩短了分析检测的时间。其中所述的组成A相或B相的有机溶液可以是一致的，也可以是不一致的；优选地所述的组成A相或B相的有机溶液是一致的；所述有机溶液可以是甲醇、乙腈或其混合物；优选乙腈。其中，当A相是阴离子对试剂水溶液与有机溶液的混合液时，有机溶液的含量是0％～50％，或是5％～20％，优选10％，体积比。在一些实施例中，本专利技术所述方法的色谱柱可以是以辛烷硅烷键合相作为填料的色谱柱，柱温可以是20～60℃；在一些实施例中色谱柱是Agilent RX C8，4.6X250mm，5μm，柱温是40℃。在一些实施例中，本专利技术所述的方法的紫外检测器的检测波长可以是210～280nm，更加优选的是260nm。检测波长的选择可以根据待测化合物的紫外吸收强度进行适当调节，是分析领域的公知常识，在获得待测物的紫外吸收曲线的前提下，替换是可以预测的。在一些实施例中，本专利技术所述的方法的流速可以是0.2～2ml/min；优选的是0.5～1.5ml/min；更加优选的是1.0ml/min。本专利技术所述的阴离子对试剂可以是选自辛烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠和十二烷基磺酸钠中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法，其特征是：采用以十八烷基硅烷键合相或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱柱；流动相由作为A相的阴离子对试剂水溶液或其与有机溶液的混合液和作为B相的有机溶液组成，进行洗脱；采用紫外检测器对利奥西呱原料药的有关物质进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种采用HPLC分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法，其特征是：采用以十八烷基硅烷键合相
或辛烷硅烷键合相作为填料的色谱柱；流动相由作为A相的阴离子对试剂水溶液或其与有机溶液的混
合液和作为B相的有机溶液组成，进行洗脱；采用紫外检测器对利奥西呱原料药的有关物质进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是采用梯度洗脱的方式进行的，其中梯度洗脱至少包含两
个阶段梯度变化，其中第一阶段梯度变换是在0～60min的时间内，A相在流动相中的含量是66％～80％，
体积比；第二阶段梯度变化是第一阶段梯度变化的时间基础上在接下来的10～60min内进行，A相在流
动相中的含量由66％～80％变化至31.5％～38.5％，体积比。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的A相是由阴离子对试剂水溶液与有机溶液组成的，其中阴离
子对试剂水溶液与有机溶液的体积比是约0％～50％。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述的有机溶液是甲醇、乙腈或其混合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中紫外检测器的检测波长在210～280nm之间；流动相流速是
0.5～1.5ml/min；色谱柱温度是20～60℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的阴离子对试剂是选自辛烷磺酸钠、戊...

【专利技术属性】
技术研发人员：文景兵，饶万兵，刘国柱，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44