本发明专利技术涉及丙型肝炎病毒(HCV)细胞进入抑制肽ZTE2序列及应用。所述多肽是根据HCV基因型2a参考株JFH-1的包膜蛋白E2的氨基酸序列合成(纯度＞85％)的15肽。本发明专利技术中发现多肽E2-78和E2-79，如Seq ID：No.1和Seq ID：No.2所示氨基酸序列，重叠的10个氨基酸命名为ZTE2，序列如Seq ID：No.3。在剂量为10nM时，对HCVcc(Jc1p7NS2Gluc2a)感染的抑制率可以达到80％以上，分析确定这四条肽的半数有效剂量(ED50)为5nM左右。多肽与HCVcc共孵育(0h)或HCVcc感染后(+4h)共孵育的情况下，多肽皆能明显抑制HCV感染，通过截短肽的合成及抑制筛选分析初步确定了抑制肽的核心序列。这一发现具有重要的意义，不仅可以帮助理解该新发病毒感染的过程和机制，也能为阻断HCV感染提供新的设计思路。
【技术实现步骤摘要】
丙型肝炎病毒（HCV)细胞进入抑制肽ZTE2序列及应用
本专利技术属于病毒分子生物学领域。涉及利用HCV包膜蛋白E2的多肽对 HCV感染的防治。
技术介绍
丙型肝炎病毒（HCV)为黄病毒属，单股正链RNA病毒，全长基因组约有 9600个核苷酸组成，形成单一的开放阅读框，编码一个约3000个氨基酸的单一多蛋白，在 病毒自身编码的蛋白酶及宿主编码的信号肽酶的切割加工下，形成4个结构蛋白（Core， El，E2, p7)和 6 个非结构蛋白（NS2, NS3, NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。HCV 引发的丙型肝炎， 急性感染者中约80%发展为慢性，其中约20%发展为肝纤维化和肝硬化，并可能进一步发 展为肝癌。目前全球约有1. 7亿感染者，我国约有4000万，HCV感染已经成为全球性的社 会公共卫生问题之一。 丙型肝炎病毒的高度变异性，给疫苗的研究造成了极大的困难。目前对HCV感染 的治疗从单一的聚乙二醇-干扰素（PEG-IFN)或者与利巴韦林（RBV)的联合用药外，直接 靶向病毒的药物（DAAs)及靶向宿主的抗病毒药物（HTAs)陆续出现。美国FDA已经批准 两种抑制HCV复制的药物，即直接靶向HCVNS3/4A蛋白酶的抑制剂，分别是Vertex公司的 telaprevir及Merck公司的Boceprevir。另外祀向宿主的抗病毒药物也相继进入临床II 期试验，包括靶向HCV进入宿主细胞受体SR-BI的抑制剂：ITX-5061等[1]。虽然目前的治 疗效果较好，但是副作用大，价格昂贵，因此寻找防治HCV感染的有效靶点仍然需要众多研 究者共同努力。 在病毒感染细胞的生物过程中，病毒与宿主细胞膜表面受体的特异性结合是病毒 感染的最初环节，型别不同的同种病毒在与细胞结合过程中作用分子一般是固定的，如果 能够阻碍两者之间的结合，即可以有效抑制病毒性感染的发生。2003年美国FDA批准抗人 免疫缺陷病毒（HIV)的新药T-20 (Enfuvirtide)上市，Τ-20是穿入抑制剂中第一个上市的 药物，含有36aa，能够与HIV包膜蛋白gp41结合，阻止病毒与祀细胞的融合，临床试验证明 效果较好，受试者副反应较小 [2]。 目前已经证明HCV的包膜糖蛋白E1E2是与宿主细胞受体结合的唯一关键分子，其 中E2被认为是最重要的分子。1998年Pileri等的研究表明人⑶81 (h⑶81)可能是HCV的 受体，随后低密度脂蛋白受体（LDLR)、清道夫受体B族I型（SR-BI)、钙离子依赖型（C型） 凝集素 DC/L-SIGN、Occludin和细胞连接骨架蛋白Clauding-I等都被证实是HCV的可能 受体，目前比较一致的看法为HCV是通过包膜糖蛋白E2与⑶81特异性结合，使病毒吸附于 靶细胞表面，但由于CD81介导的内吞作用弱，病毒最终进入细胞可能还需要其他分子，如 LDLR、SR-BI等来辅助，Clauding-I则在病毒穿入过程的后期起到关键作用[3_8]。 我们通过分析HCV基因型2a的参考株JFH-I (GenBank no. D95A86)包膜糖蛋白 E1E2,人工合成覆盖完整E1E2氨基酸序列的多肽126条，其中El有37条，E2有89条，每 条多肽由15aa组成，相邻两条多肽有IOaa重叠。运用HCVcc(FLJclp7NS2Gluc2a)对以上 合成的多肽进行筛选，研究发现位于包膜糖蛋白E2氨基酸序列692-710aa位置的两条多 肽E2-78, E2-79,在IOnM的浓度下，对HCV感染的抑制率可以达到抑制80 %左右，半数有 效抑制浓度约为5nM。在研究多肽与病毒作用关系的试验中，多肽与病毒共孵育（Oh)和 感染后孵育（+4h)的情况下，与阴性对照（DMSO)相比，多肽的加入能够明显抑制HCV感染 Huh7. 5CD81细胞，具体表现为感染细胞中HCV特异性蛋白Core的表达量下降，病毒RNA的 拷贝数下降，细胞培养上清中Gluc荧光素酶的活性下降。该实验证明本次筛选获得的两条 多肽，是通过阻止病毒进入细胞的生物过程而发挥作用的，具体是否是通过与病毒竞争性 的结合靶细胞表面的受体的方式发挥抑制感染的效果，还需要深入研究。 这一发现具有重要的意义，不仅可以帮助理解该新发病毒感染的过程和机制，也 能为阻断HCV感染，尤其是肝移植病人再感染的预防治疗提供新的设计思路，希望能为研 发理想的HCV预防/治疗性候选药物提供参考依据。
技术实现思路
： 本专利技术解决的问题在于提供抑制丙型肝炎病毒（HCV)的多肽ZTE2,筛选能与HCV 包膜糖蛋白E2结合的多肽序列，获得以HCV E2为靶位的多肽，以阻断病毒与细胞的结合， 从而抑制病毒侵染细胞。 本专利技术是通过以下技术方案来实现： 抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽，该多肽的序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO : 2所示。重叠核心多肽ZTE2的序列如SEQ ID NO :3所示。 所述的抑制丙型肝炎病毒侵染细胞的多肽应用于丙型肝炎病毒侵染细胞的吸附 抑制剂或阻断剂。 本专利技术提供的多肽E2-78, E2-79,能够阻断HCV进入细胞，通过分泌Gluc荧光素 酶的HCVcc系统检测多肽E2-78, E2-79对HCV入胞的抑制作用，结果显示E2-78, E2-79对 HCVcc感染细胞具有一定的抑制效果，可以作为HCV的吸附抑制剂或阻断剂。 【附图说明】 图 I :HCVcc FLjclp7NS2Gluc2a 的结构示意图。 图2 :对照病毒VSVpp-Gluc的结构示意图。 图3 :多肽的初步筛选结果。 图4 :多肽的第二轮筛选结果。 图5 :多肽的半数有效抑制浓度的测量结果。 图6 :MTT检测多肽对细胞活力的影响。 图7 :多肽与病毒作用关系的间接免疫荧光结果。 图8 :多肽与病毒作用关系的Western blotting结果。 图9 :多肽与病毒作用关系的感染抑制率结果。 图10 :多肽与病毒作用关系RNA拷贝数的检测结果。 图11 :多肽与其他抗病毒药物的联合应用对HCV感染的抑制效果。 图12 :多肽核心序列的确定 图13 :多肽序列信息表 【具体实施方式】： 下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而 不是限定。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验 指南》（第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家 所建议的条件进行。 实施例1 :多肽的合成信息 试验所用多肽是根据HCV基因型2a JFH-I的包膜蛋白E1E2的氨基酸序列合成的 15肽，相邻两条多肽之间有10个氨基酸的重叠。其中包膜蛋白El的多肽有37条，包膜蛋 白E2的多肽有89条，多肽的纯度大于85%。所有的多肽均有上海强耀生物科技有限公司 合成。 实施例2 :多肽筛选 将多肽溶解于100%的DMSO中，配制成母液浓度为5μΜ/πι1，然后以10μ 1为单 位分装10份，尽量避免反复冻融，一并冻存于零下20°C。根据参考文献中的多肽剂量为本文档来自技高网...
【技术保护点】
抑制丙型肝炎病毒(HCV)的多肽药物ZTE2其特征在于，位于丙型肝炎病毒包膜糖蛋白E2区。
【技术特征摘要】
1. 抑制丙型肝炎病毒（HCV)的多肽药物ZTE2其特征在于，位于丙型肝炎病毒包膜糖蛋 白E2区。2. 权利要求1所述的ZTE2它具有SEQ...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭文杰，张玲，卢莎，邓瑶，陶格斯，刘晓明，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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