一种α‑葡萄糖苷酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种α‑葡萄糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明专利技术的α‑葡萄糖苷酶的最适作用温度为60℃，且在50‑65℃范围内能保持80％以上的酶活力；最适作用pH为4.5，且在pH3.0‑6.0范围内能保持80％以上的酶活力。该α‑葡萄糖苷酶能高效转化麦芽糖，转化产物中异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖的含量最高，分别达到44.1％、23.0％和21.2％，三糖总含量为88.3％。因此，本发明专利技术所述α‑葡萄糖苷酶可广泛应用于低聚异麦芽糖浆的生产，市场前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种Ct-葡萄糖苷酶及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种葡萄糖苷酶及其应用。
技术介绍
a-葡萄糖苷酶（a-glucosidase，简称AGLU酶，EC3. 2. 1. 20)，又名a-D-葡萄 糖苷水解酶，它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开a-1，4糖苷键，释放出葡萄糖；或 将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物上形成a-1，6糖苷键，从而形成具有非发酵 性的功能性低聚糖--低聚异麦芽糖（简称頂〇s，主要包括异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖 等）。工业上a-葡萄糖苷酶主要应用于低聚异麦芽糖的大量生产。低聚异麦芽糖是一类 含有至少一个a-(1，6)糖苷键的低聚糖，主要是异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖，天然少量存 在于酱油，蜂蜜中，它己经慢慢被用来替代传统的蔗糖作为食品添加剂。它被摄入人体后不 会被消化道吸收，也不能被有害菌利用，但可以被肠道的益生菌如双歧杆菌作为碳源利用， 故其具有良好的双歧因子作用，可以改善人体肠道的功能。此外，由于低聚异麦芽糖的甜度 只有普通糖的一半，可以有效防止儿童龋齿，适宜糖尿病人食用，可以作为饮料糖果和保健 品的添加剂。在饲料工业中，低聚异麦芽糖被认为可以在提高家禽存活率的同时，又不会存 在合成饲料带来对人体的副作用，据报道，日本50%左右的饲料中都含有低聚异麦芽糖。目 前，低聚异麦芽糖已经在食品、医药和饲料加工行业有了很广泛的应用。 生产AGLU酶的微生物种类有细菌、曲霉、古细菌等。现在工业上生产环糊精所使 用的AGLU酶主要来自黑曲霉。由于能分泌AGLU酶的野生菌株的生产能力普遍较低，为了克 服野生菌株的低生产能力，国内外研究者通过构建基因工程菌生产重组AGLU酶。在国内， 对a-葡萄糖苷酶的研究还主要在a-葡萄糖苷酶的生产菌种选育和酶学性质方面，虽然 有通过RT-PCR方法扩增得到A.nigera-葡萄糖苷酶cDNA，构建重组质粒并尝试在大肠杆 菌中表达，但酶表达量偏低，而且重组蛋白是胞内酶，分离纯化的成本相对高。 迄今为止，国内生产低聚异麦芽糖用a-葡萄糖苷酶主要依赖日本进口，为了降 低低聚异麦芽糖的商业成本，首先必须降低葡萄糖苷酶的生产成本。因此，进一步筛选 出性能优良的a-葡萄糖苷酶基因并实现其在宿主菌中的高效表达成为当前研究的热点。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种新型a-葡萄糖苷酶及其应用。本专利技术 通过将来源于黑葡萄穗霉（Stachybotryschartarum)的a-葡萄糖苷酶基因转化入黑曲 霉（Aspergillusniger)中，构建得到重组工程菌株，实现了该酶在体外的高效表达，为其 商业化应用奠定了基础。 本专利技术一方面提供了一种a-葡萄糖苷酶，其特征在于： 1)其氨基酸序列为SEQIDN0 :1的a-葡萄糖苷酶； 2)在1)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有1)中 a-葡萄糖苷酶活性的酶。 本专利技术另一方面提供了编码上述a-葡萄糖苷酶的基因，其一种核苷酸序列为 SEQIDN0:2。 本专利技术提供了一种表达载体，其包含上述编码a-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。 本专利技术还提供了一种表达宿主细胞，其携带有表达上述a-葡萄糖苷酶基因的表 达载体。 上述表达宿主细胞为黑曲霉（Aspergillusniger)。 本专利技术提供了一种新型a-葡萄糖苷酶，并构建得到了表达该酶的黑曲霉重组菌 株。本专利技术的a-葡萄糖苷酶的最适作用温度为60°C，且在50_65°C范围内能保持80% 以上的酶活力；最适作用pH为4.5,且在pH3. 0-6.0范围内能保持80%以上的酶活力。该 a-葡萄糖苷酶能高效转化麦芽糖，转化产物中异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖的含量最高， 分别达到44. 1 %、23.0%和21. 2%，三糖总含量为88. 3%。因此，本专利技术所述a-葡萄糖苷 酶可广泛应用于低聚异麦芽糖浆的生产，市场前景广阔。 【附图说明】 图1 :本专利技术构建的pGm-aglu重组表达载体质粒图谱。 图2 :黑曲霉aglu发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中M所示为蛋白标准分子 量标记，由上至下为116. 0kD，66. 2kD，45. 0kD，35. 0kD，25.OkD;泳道1所示为宿主菌黑曲霉 G1分泌蛋白表达情况；泳道2、3、4所示为重组菌株黑曲霉aglu分泌蛋白表达情况，箭头所 指90kDa处为本专利技术所述来源于的黑葡萄穗霉的a-葡萄糖苷酶。 图3:本专利技术a-葡萄糖苷酶相对酶活_温度曲线图。 图4 :本专利技术a-葡萄糖苷酶相对酶活-pH曲线图。 【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术的a-葡萄糖苷酶进行详细的描述。 实施例1 :a-葡萄糖苷酶基因的克隆 使用真菌基因组DNA提取试剂盒（Omega)从黑葡萄穗霉过夜培养物中提取基因组 DNA。 以黑葡萄穗霉基因组DNA为扩增模板扩增黑葡萄穗霉中的a-葡萄糖苷酶基 因，其中所用到的正向引物aGluS6480-F序列为（下划线所示序列为SnaBI酶切位点）；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α‑葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的α‑葡萄糖苷酶包含有：1)氨基酸序列为SEQ ID NO：1的α‑葡萄糖苷酶；2)在1)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有1)中α‑葡萄糖苷酶活性的酶。

【技术特征摘要】
1. 一种a-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的a-葡萄糖苷酶包含有： 1) 氨基酸序列为SEQ ID NO :1的a -葡萄糖苷酶； 2) 在1)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有1)中 a -葡萄糖苷酶活性的酶。2. -种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的a-葡萄糖苷酶。3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华明，徐娟，黄亦钧，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37