寄生曲霉及其在亚硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶基因和基因工程菌制备中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种寄生曲霉及其在亚硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶基因和含有亚硝酸盐还原酶的基因工程菌制备中的应用，寄生曲霉的保藏编号为CCTCC M2013662。本发明专利技术提供一种高效低能耗、对亚硝酸盐降解效果好、降解快速可靠的寄生曲霉。并且该寄生曲霉可在亚硝酸盐还原酶制备、亚硝酸盐还原酶基因制备及含有亚硝酸盐还原酶的基因工程菌制备中有良好应用。

【技术实现步骤摘要】
寄生曲霉及其在亚硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶基因和基因工程菌制备中的应用
本专利技术属于微生物
，涉及一种曲霉及其应用，尤其涉及一种寄生曲霉，以及该寄生曲霉在亚硝酸盐还原酶制备、亚硝酸盐还原酶基因制备及含有亚硝酸盐还原酶的基因工程菌制备中的应用。
技术介绍
亚硝酸盐是自然界中最常见的含氮化合物之一，其来源也十分广泛，亚硝酸盐是一种有害的化学物质，亚硝酸盐与人体血液作用，形成高铁血红蛋白，从而使血液失去携氧功能，使人缺氧中毒，轻者头昏、心悸、呕吐、口唇青紫，重者神志不清、抽搐、呼吸急促，抢救不及时可危及生命。不仅如此，亚硝酸盐在人体内还可与仲胺类作用形成亚硝胺类，后者在人体内达到一定剂量时是致癌、致畸、致突变的物质，可严重危害人体健康。随着我国水产业的迅速发展，养殖密度和规模逐渐增大，养殖水的水质污染也随之加重，其中亚硝酸盐含量过高是水质污染的主要因素之一，因为亚硝酸盐的含量超标会严重危害鱼类等水产动物的正常生长。目前降低水质中以及食品中残留的亚硝酸盐含量的方法很多，比如离子交换法、反渗透法、电渗析法、微生物降解法、化学法等。但是，这些方法存在很多问题，其中反渗透法、电渗析法、离子交换法均是将亚硝酸盐集中于介质或废液中，易造成二次污染，且效率低、投资较大，主要用于对工业用水的处理；化学还原法尽管可以将亚硝酸根还原为无害的氮气,但其反应需要在较高温度下进行,效率也较低，不适宜于对养殖水和食品的处理；化学氧化法虽具有设备简单、处理费用相对较低的优点，但仅适用于对亚硝酸盐含量较低、处理量较少的地下深水的处理，不适宜于对养殖水和食品的处理。生物法具有高效低耗的优点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种高效低能耗、对亚硝酸盐降解效果好、降解快速可靠的寄生曲霉。本专利技术进一步要解决的技术问题在于，提供该寄生曲霉在亚硝酸盐还原酶制备、亚硝酸盐还原酶基因制备和含有亚硝酸盐还原酶的基因工程菌制备中的应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种寄生曲霉(Aspergillussp.JFS)，保藏编号为CCTCCNO：M2013662，保藏时间：2013年12月11日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。该寄生曲霉的GenBank登录号为KJ847706、KJ847707和KJ847708。本专利技术的寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)JFS是从重庆市荣昌县金佛镇的一个鱼池水样中分离得到。该寄生曲霉菌株是一株可以强烈降解亚硝酸盐的真菌。将该菌株JFS接种在察氏平板上，将平板置于30℃恒温培养，观察菌落的特征：该菌株JFS在培养4天时，菌落直径为2.6cm，此时，菌落正面呈现出4个同心圈形，菌落最中间是乳白色菌丝状，由里向外第二层有很多金黄色孢子，由里向外第三层有很多白色孢子，最外层是乳白色菌丝，菌落背面为浅棕色。9天时菌落直径5.0cm，此时，平板上有很多白色孢子和墨绿色孢子，同时平板上出现了很多棕黑色液滴，平板背面为深棕色。孢子的颜色随着培养时间延长由浅到深，最初为淡黄色，然后变为绿色，最后变为棕黑色。载玻片温室培养显微观察和电子显微镜观察：营养菌丝有隔、分枝、透明，分生孢子梗自菌丝生出，可单生或对生，直立，细长，大都简单，顶端渐粗，末端扩展成由1列小梗排列成木栅状的顶囊，顶囊球形，小梗上有成串的2.81-3.6μm的球形分生孢子，分生孢子头犹如花菜样、表面不光滑。将寄生曲霉菌株JFS在察氏平板上培养3-6天后，提取其基因组DNA，对该DNA进行扩增，并分别用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，切割所需DNA目的条带测序。对菌株JFS的ITSrDNA序列、β-Tubulingene序列和Calmodulingene序列的PCR产物测序后发现其ITSrDNA序列共有576bp，β-Tubulingene序列共有522bp，Calmodulingene序列共有749bp。分别将其ITSrDNA序列、β-Tubulingene序列和Calmodulingene序列输入NCBIGenBank中blast，用MEGA5.2.1软件构建系统发育树，菌株JFS均与Aspergillusparasiticus和Aspergillusarachidicola(目前种Aspergillusarachidicola的概念还不清楚)聚到了同一个分支，亲缘关系最近。综上，通过综合菌落形态、菌丝形态、分生孢子形态、培养条件及分子生物学鉴定结果，该菌株属于真子囊菌亚纲散囊菌目发霉科曲霉属的寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)。由于本专利技术的寄生曲霉菌株JFS能在亚硝酸盐为唯一氮源的培养基中较好的生长，有很强、很快的降解亚硝酸盐的能力，在初始浓度为4mg/L的亚硝酸钠培养液中120h的亚硝酸钠降解率为99.8％，在亚硝酸钠的浓度高达20.0g/L时仍能较好的生长，并且发现亚硝酸钠的浓度越高该菌株生长得越好，在有氧和无氧条件下该菌株均能较好的生长。本专利技术的寄生曲霉菌株JFS除了利用亚硝酸盐合成自身的结构蛋白及功能蛋白以外，还将有毒的亚硝酸盐降解为无毒的硝酸盐和NH4+，同时该菌株还可以继续利用产物硝酸盐。本专利技术的寄生曲霉菌株JFS的发现，填补了真菌在降解亚硝酸盐方面的空白。相对现有技术，本专利技术的寄生曲霉在亚硝酸盐降解过程中实现高效低能耗，且对亚硝酸盐降解效果好、降解快速可靠。由于该菌株对亚硝酸盐有很强的降解能力，可应用于蛋白酶工程及基因工程：本专利技术寄生曲霉应用的第一种实施方案为：寄生曲霉在亚硝酸盐还原酶的制备中应用。采用本专利技术寄生曲霉来制备亚硝酸盐还原酶，能降低培养成本，并且能为亚硝酸盐还原酶的制备提供充足来源，使其可直接用于去除食品原料和养殖水中的亚硝酸盐。本专利技术寄生曲霉应用的第二种实施方案为：寄生曲霉在亚硝酸盐还原酶基因的制备中应用。寄生曲霉的应用提供了更方便的途径，来研究自然界中亚硝酸盐还原酶基因的多样性。本专利技术寄生曲霉应用的第三种实施方案为：寄生曲霉在含有亚硝酸盐还原酶的基因工程菌制备中的应用。采用本专利技术的寄生曲霉能更方便制备更多种类的基因工程菌，扩展其应用范围。附图说明下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中：图1是本专利技术实施例1的菌株生长四天时的照片；图2是本专利技术实施例1的菌株生长九天时的照片；图3是本专利技术实施例1的在光学显微镜下的分生孢子梗和分生孢子头；图4-6都是本专利技术实施例1的在电子显微镜下的分生孢子头；图7是本专利技术实施例1的菌株JFS基于ITSrDNA序列的基因同源性的系统发育树；图8是本专利技术实施例1的菌株JFS基于β-Tubulin基因序列的基因同源性的系统发育树；图9是本专利技术实施例1的菌株JFS基于Calmodulin基因序列的基因同源性的系统发育树；图10是本专利技术实施例1的亚硝酸钠浓度标准曲线；图11是本专利技术实施例1的培养液中亚硝酸钠浓度随培养时间变化趋势图。具体实施方式为了对本专利技术的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本专利技术的具体实施方式。实施例1、寄生曲霉菌株JFS的筛选、培养、鉴定和性能检测1.寄生曲霉菌株JFS的筛选：(1)材料a.样品：采自四川成都、四川本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寄生曲霉，其特征在于，其保藏编号为CCTCC M2013662。

【技术特征摘要】
1.一种寄生曲霉，其特征在于，其保...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘冰花，杨林，蒲小龙，罗亚雄，袁管明，
申请(专利权)人：成都大学，
类型：发明
国别省市：四川;51