一种亚硝酸盐还原酶及其编码基因制造技术

本发明专利技术提供了一个新的亚硝酸盐还原酶基因，其编码的亚硝酸盐还原酶最适pH5.5；最适反应温度35℃；经0.1M pH5.5缓冲液在30℃-50℃下处理1h，仍能保持90％以上的活性；具有较好的水解亚硝酸盐的能力；可作为饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。

【技术实现步骤摘要】
一种亚硝酸盐还原酶及其编码基因
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种亚硝酸盐还原酶及其编码基因。
技术介绍
由于农业上氮肥的大量使用，环境中硝酸盐和亚硝酸盐大量富集，致使农产品、食品以及饲料中有大量的亚硝酸盐残留。而亚硝酸盐是一种对人体有害的物质，它不仅使人、畜禽直接中毒、致死，而且是致癌物亚硝胺的前体，据研究，食道癌与患者摄入的亚硝酸盐量呈正相关。亚硝酸盐还原酶能够将饲料、食品以及环境中的亚硝酸盐还原成氨或是一氧化氮。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种亚硝酸盐还原酶。本专利技术的另一目的是提供编码上述亚硝酸盐还原酶的基因。本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本专利技术所述亚硝酸盐还原酶XW4NIR可得自类芽孢杆菌(PaenibacillusAsh)，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供的亚硝酸盐还原酶XW4NIR总共含313个氨基酸，理论分子量为34kDa。该酶的最适pH值为5.5，在pH4.0–7.5的范围内维持50％以上的酶活性；经pH5.5的缓冲液在30℃-50℃下处理1h，仍能保持90％以上的活性；该酶最适温度为35℃；在pH5.5及37℃下，该酶对0.5％(w/v)亚硝酸钠的比活力为1548.12±66.81U/mg。本专利技术提供了编码上述亚硝酸盐还原酶的基因XW4N，该基因序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术通过PCR的方法分离克隆了亚硝酸盐还原酶XW4NIR的编码基因XW4N，其全长942bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。经BLAST比对，该亚硝酸盐还原酶基因XW4N编码的氨基酸序列与GenBank中nitritePaenibacillussp.HGF5来源的潜在亚硝酸盐还原酶假定蛋白具有最高的一致性，为49％，说明亚硝酸盐还原酶XW4NIR是一种新的亚硝酸盐还原酶。本专利技术还提供了包含上述亚硝酸盐还原酶基因XW4N的重组载体，优选为pET-XW4N。将本专利技术的亚硝酸盐还原酶基因XW4N插入到表达载体的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，将本专利技术的亚硝酸盐还原酶基因插入到质粒pET-28a(+)上的HindIII和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒pET-XW4N。本专利技术还提供了包含上述亚硝酸盐还原酶基因XW4N的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、类芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/XW4N。本专利技术制备亚硝酸盐还原酶XW4NIR的方法按以下步骤进行：(1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导重组亚硝酸盐还原酶表达；(3)回收并纯化所表达的亚硝酸盐还原酶XW4NIR。其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/XW4N。本专利技术提供了一个新的亚硝酸盐还原酶基因，其编码的亚硝酸盐还原酶最适pH5.5；最适反应温度35℃；经0.1MpH5.5缓冲液在30℃-50℃下处理1h，仍能保持90％以上的活性；具有较好的水解亚硝酸盐的能力；可作为饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。附图说明图1为本专利技术实施例提供的亚硝酸盐还原酶的SDS-PAGE分析图，其中，M：低分子量蛋白质Marker；l：纯化的重组亚硝酸盐还原酶XW4NIR；图2为本专利技术提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与pH值的曲线关系图；图3为本专利技术提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与pH值在不同时间的曲线关系图；图4为本专利技术提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与温度的曲线关系图；图5为本专利技术提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与温度在不同时间的曲线关系图；图6为本专利技术提供的亚硝酸盐还原酶的相对酶活与金属离子的柱状图。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：类芽孢杆菌(PaenibacillusAsh)来源于实验室保存菌株。大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)和表达载体pET-28a(+)购于Novagen公司。2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；其它均为国产试剂。3、培养基：LB培养基：Peptone10g，Yeastextract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1：亚硝酸盐还原酶基因XW4N的克隆提取类芽孢杆菌基因组DNA：将类芽孢杆菌于平板划线培养单菌落，挑取单菌落于20mL培养基过夜培养，收集菌体提取基因组DNA。从LB平板上刮取3-5个菌落，加入180μL溶菌酶37℃条件下处理1h后加入20μL蛋白酶K，混匀后加入220μLGB溶液，震荡，70℃放置10min；加入220μL无水乙醇，混匀；将其转到吸附柱中，于12000rpm离心1min，向吸附柱中加入500μLGD溶液，离心1min，；向吸附柱中加600μL漂洗液PW，离心1min，弃废液；重复一次后再离心2min，晾干(37℃开盖10min)；滴加50μL洗脱缓冲液TE，37℃放置5min；离心2min；于-20℃保存。根据前期测序得到的核甘酸序列，设计合成引物：XW4F如SEQIDNo.3所示，为5’-ATGCAGGCCATTCTGTCTGACGGA-3’；XW4R如SEQIDNo.4所示，为5’-TCATCCAAGCACCTTCGCCTCATAA-3’；以类芽孢杆菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃预热5分钟，94℃变性45秒，50℃复性30秒，72℃延伸1分30秒，30个循环，72℃保温5分钟。实施例2：重组亚硝酸盐还原酶XW4NIR的制备以XW4NIRF和XW4NIRR为引物对，类芽孢杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃预热5分钟，94℃变性45秒，52℃复性30秒，72℃延伸1分30秒，30个循环，72℃保温5分钟。PCR结果得到亚硝酸盐还原酶的基因XW4N，并在该基因5’和3’端分别引入了HindIII和XhoI酶切位点。将编码亚硝酸盐还原酶的基因XW4N进行双酶切(HindIII和XhoI)，同时将表达载体ET-28a(+)进行双酶切(HindIII和XhoI)。将上述酶切的亚硝酸盐还原酶XW4NIR与表达载体pET-28a(+)相连接，获得含有亚硝酸盐还原酶基因XW4N的重组质粒pET-XW4N并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/XW4N。取含有重组质粒pET-XW4N的E.coliBL21(DE3)菌株和只含有pET-28a(+)空质粒的E.coliBL21(DE3)菌株，以0.1％的接种量接种于LB(含50μg/mLAmp)培养液中，37℃培养16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含50μg/mLAmp)培养液中，振荡培养约2–3h(OD538达到0.6–1.0)后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亚硝酸盐还原酶，其特征在于，其具有(I)或(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(II)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种亚硝酸盐还原酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种编码如权利要求1所述的亚硝酸盐还原酶的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.包含权利要求2或3所述基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄遵锡，刘凌云，谢振荣，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53