一株禽流感H9N2亚型病毒株及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株禽流感H9N2亚型病毒株及其应用，属于动物病毒学领域。本发明专利技术的禽流感H9N2亚型病毒株命名为WF，其保藏编号为CGMCC No.9459。本发明专利技术提供的病毒株为低致病性毒株，具有良好的特异性和免疫原性，免疫雏鸡能产生针对H9亚型的特异HI抗体，对H9N2亚型禽流感病毒的攻击能产生很好的保护效果。本发明专利技术提供的禽流感H9N2亚型病毒WF株可作为疫苗毒株，预防禽类的H9亚型禽流感，具有较好的经济效益和社会效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物病毒学领域，具体地，涉及一株H9N2亚型禽流感病毒株及其应用。
技术介绍
禽流感(Avian influenza,AI)是由A型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)感到染家禽后引起的各种综合征，从临诊症状感染到呼吸道疾病和产蛋下降，到死亡率接近100％的严重全身性疾病不等。禽流感病毒属于正粘病毒科，流感病毒属。血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Nueraminidase，NA)是病毒的两种主要保护性抗原，根据HA、NA的抗原性差异，可将A型流感病毒分为不同的亚型。迄今为止，A型禽流感病毒的HA已发现16种，NA有10种，分别以H1～H16、N1～N10命名，各种亚型的A型流感病毒均能感染家禽，不同H抗原或N抗原之间无交叉反应。AIV根据其致病性可分为高致病性AIV，主要为H5、H7；低致病性AIV，主要为H9。H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在，是当前禽流感流行的主要型别之一。我国大陆自1994年首次分离到H9N2亚型禽流感病毒以来，先后从不同地区分离到多株相同亚型的禽流感病毒。该亚型禽流感常常继发或并发感染新城疫、大肠杆菌等疾病引起大批的鸡只死亡，给我国畜牧业带来了严重的经济损失。虽然H9亚型禽流感灭活疫苗已广泛应用，该病也得到了有效控制，但是近几年来H9亚型禽流感在免疫鸡群中仍时有发生。解决这一难题，有赖于对本地区流行毒株进行筛选和分离，选择保护力好的H9N2禽流感疫苗毒株，以使禽流感的防控更具有针对性和有效性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种H9N2亚型病毒毒株。本专利技术的另一目的在于提供该H9N2亚型禽流感病毒毒株的应用。本专利技术提供的一株H9N2亚型禽流感病毒毒株WF株，是在2012年3月，山东某肉鸡场发病鸡只体内分离得到。该鸡场的鸡只11日龄开始发病，饮水减少，临床症状表现为怪叫，张口呼吸，偶见猝死，2天后死亡率升高，可达3％。剖检可见少数喉头有轻微出血，严重的气囊炎，气管出血，有粘液，支气管栓塞，有白色干酪样物质，肺脏出血，肾脏水肿。自这些发病鸡的体内分离并鉴定得到一株H9N2亚型禽流感病毒，定名为A/Chicken/Sandong/WF/2012(H9N2)株(简称WF株)。该毒株已于2014年7月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC No.9459，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为H9N2亚型禽流感病毒，保藏号为CGMCC No.9459。本专利技术提供的禽流感H9N2亚型病毒毒株WF，其HA蛋白含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；其NA蛋白含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。使用含有该分离毒的鸡胚尿囊液对1％鸡红细胞产生凝集，凝集不被鸡新城疫、禽流感AIV H5、H7亚型、减蛋综合症(EDS)等病毒单因子阳性血清抑制，鸡胚出现规律性出血。通过1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)测定、6周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)测定，证明该禽流感分离毒为低毒力毒株。外源病毒检测发现，病毒分离物免疫SPF鸡的血清只呈现H9禽流感抗体阳性反应，而其他鸡11种疾病均为抗体阴性反应。本专利技术中制备的禽流感疫苗，其有效成分为灭活后的WF株病毒。所制备疫苗是针对禽H9N2亚型的流感病毒的疫苗。该疫苗利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本专利技术中制备的禽流感灭活疫苗对禽具有很好的保护力。进一步地，含有禽流感H9N2亚型病毒毒株WF或其重组病毒株的生物制品也属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了禽流感H9N2亚型病毒毒株WF在制备禽流感疫苗中的应用。本专利技术提供了禽流感H9N2亚型病毒毒株WF在制备禽流感病毒诊断用抗原试剂中的应用。本专利技术提供了禽流感H9N2亚型病毒毒株WF在制备禽流感病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。本专利技术提供了禽流感H9N2亚型病毒毒株WF在制备禽流感病毒治疗用抗血清试剂中的应用。本专利技术提供的禽流感H9N2亚型病毒株WF具有良好的特异性和免疫原性，实验发现，其不能被抗NDV阳性血清、抗EDS76阳性血清、抗M41阳性血清、抗H5亚型禽流感阳性血清以及抗H7亚型禽流感病毒阳性血清抑制，而能被H9亚型禽流感病毒阳性血清所抑制。通过生物学特性试验、血清中和试验和外源病毒检测，证实该病毒具有良好的纯净度。通过1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)测定、6周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)测定，证明该禽流感病毒为低致病性毒株。WF株对鸡胚的半数感染量为EID50＝10-7.68/0.1ml，用WF株制得的疫苗免疫雏鸡能产生针对H9亚型的特异HI抗体平均达10log2，对H9N2亚型禽流感病毒的攻击能产生很好的保护效果。本专利技术提供的禽流感H9N2亚型病毒毒株可作为疫苗毒株，预防禽类的H9亚型禽流感，尤其对WF分离源地区的禽流感防治效果优于现有的禽流感疫苗，对禽流感病毒的防治具有重要的价值。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。本专利技术实施例中所用的SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。禽流感H5、H7和H9阳性抗血清购自哈尔滨维科生物技术有限公司；新城疫(ND)、减蛋综合症(EDS76)、传染性支气管炎病毒M41抗血清购自中国兽医药品监察所。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1 禽流感H9N2亚型病毒毒株WF株的分离和鉴定1.病毒分离  山东某肉鸡场鸡只11日龄开始发病，饮水减少，临床症状表现为怪叫，张口呼吸，偶见猝死，2天后死亡率升高，可达3％。剖检可见少数喉头有轻微出血，严重的气囊炎，气管出血，有粘液，支气管栓塞，有白色干酪样物质，肺脏出血，肾脏水肿。无菌采集发病鸡肝、脾、肺、脑、胰腺剪碎研磨，称重量后分别按照1:3的重量比加入灭菌的PBS，4℃、8000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌1.5ml离心管中，加入双抗(终浓度为青霉素2000IU/ml，链霉素2mg/ml)，37℃下作用1h，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各5枚，0.2m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株禽流感H9N2亚型病毒株WF，其保藏编号为CGMCCNo.9459。

【技术特征摘要】
1.一株禽流感H9N2亚型病毒株WF，其保藏编号为CGMCC
No.9459。
2.如权利要求1所述禽流感H9N2亚型病毒株WF，其特征在
于，其HA蛋白含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述禽流感H9N2亚型病毒株WF，其特征在
于，其NA蛋白含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
4.含有权利要求1所述禽流感H9N2亚型病毒株WF或其重组
病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：张钊伟，张贺楠，于雷，黄书林，周建民，
申请(专利权)人：乾元浩生物股份有限公司，中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11