一株过表达fusA基因工程菌的构建方法及其应用技术

一株过表达fusA基因工程菌的构建方法及其应用，属于基因工程和微生物发酵技术领域。本发明专利技术利用PCR扩增克隆延伸因子EF-G基因fusA，将基因片段连接到过表达载体pDXW-8，然后电转入谷氨酸棒杆菌WY001中，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌WY001/pDXW-8-fusA。本发明专利技术构建的谷氨酸棒杆菌基因工程菌在摇瓶发酵或发酵罐发酵均可提高氨基酸的产量，并可有利于降低分离纯化难度和提高收率，从而显著降低氨基酸生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一株过表达fusA基因工程菌的构建方法及其应用
本专利技术涉及一株过表达fusA基因工程菌的构建方法及其提高氨基酸产量的应用，属于基因工程和微生物发酵

技术介绍
氨基酸是构建生物体的众多活性大分子之一，是构建细胞、修复组织的基本材料。氨基酸能够为机体和大脑活动提供能源。构成蛋白质的基本氨基酸有21种，有8种氨基酸人体不能自身合成，需从食物中获取，为人体的必需氨基酸；另外人体自身合成的精氨酸、组氨酸不能满足机体的需要，也需要从食物中摄取。氨基酸的平衡和适量供应是人体健康的基本前提，任何一种氨基酸的缺乏，都会影响免疫系统和其他正常功能的发挥。因此氨基酸在食品、医药保健、饲料方面有很广泛的应用。目前氨基酸的生产方法主要有蛋白质水解提取法、化学合成法和微生物发酵法。蛋白质水解提取法是在酸性条件下，将动植物组织水解，得到各种氨基酸混合物，经分离、纯化、精制等工序获得所需的氨基酸。但天然蛋白质的氨基酸组分复杂，提取分离难度较大，故目前生产上较少采用该方法。化学合成法虽然纯度较高，但是反应需高温高压条件，能耗大，成本高，得率较低，并且在生产工艺中涉及到了有毒有害有机溶剂的使用，安全性差，要得到具有营养价值的氨基酸，必须进行光学异构体的拆分。但是这种拆分工艺复杂，收率又低，一般也不采用。微生物发酵法是利用微生物自身酶系的催化功能，生物合成并过量积累氨基酸，具有原料成本低，生产周期短，环境污染小和产物纯度高等优点，是一种经济实用的生产方法。此外，谷氨酸棒杆菌被认为是安全的食品级生产菌株，被广泛用来生产谷氨酸，赖氨酸，缬氨酸，丙氨酸，异亮氨酸等，谷氨酸棒杆菌以其生产氨基酸安全性佳，且产生的氨基酸不被降解的特点，在生产食用和医用氨基酸中具有巨大潜力。国外主要采用发酵法生产氨基酸，国内的菌种在产量方面还低于世界先进水平，因此通过基因工程技术选育高产优良菌株，进一步提高氨基酸的产量，具有重要的经济价值和社会意义。
技术实现思路
本专利技术提供过表达fusA基因提高氨基酸产量的方法及其应用，与出发菌株相比实例菌株的氨基酸产量得到了显著提高。fusA基因编码延伸因子EF-G。延伸因子EF-G的基因序列如SEQIDNO:1所示。EF-G是一种GTP酶，蛋白质合成时，EF-G帮助核糖体在mRNA上易位。作为一种机动蛋白，驱使着tRNA和mRNA在核糖体上的定向移动。EF-G与转位前复合物的相互作用能够加速转位的进行，使速度提高1000倍，加速了核糖体的利用效率和蛋白合成速度，可以使编码氨基酸合成的关键酶大量合成，从而提高氨基酸产量。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：一株过表达fusA基因工程菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（C.glutamicumsubspecieslactofermentum）WY001/pDXW-8-fusA，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.2014233。延伸因子EF-G基因工程菌WY001/pDXW-8-fusA的构建方法，利用PCR扩增克隆延伸因子EF-G基因fusA，将基因片段连接到[x1]pDXW-8，然后利用电转化的方法转化到谷氨酸棒杆菌WY001中，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌WY001/pDXW-8-fusA。所述表达载体为诱导型表达载体。所述表达载体中的启动子为tac*；表达载体的出发载体为pDXW-8。延伸因子EF-G基因工程菌WY001/pDXW-8-fusA的构建方法，步骤如下：（1）设计引物扩增fusA上游引物：5’-CTAGCTAGCAGAAGGAGTAAATCGGTGGCTCAAGAAGTGCTTAAG-3’，下划线为NheI酶切位点；下游引物：5’-AACCCTCGAGTTAGGAAGCGGTGCCGTTGC-3’，下划线为XhoI酶切位点；（2）将PCR产物和表达载体pDXW-8分别用NheI/XhoI双酶切，回收后，将fusA和pDXW-8以6∶1～3∶1的摩尔比例，用T4连接酶在16℃连接2h，构建重组表达载体pDXW-8-fusA(如图1)；（3）然后将重组质粒pDXW-8-fusA导入谷氨酸棒杆菌WY001中，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LBHIS固体培养基30℃培养48h，筛选转化子；（4）提取筛选的转化子的质粒，用PCR验证转化子，从而获得过表达fusA基因的基因工程菌WY001/pDXW-8-fusA。本专利技术中所用到的LBHIS培养基(g/L)：胰蛋白胨5，NaCl5，酵母提取物2.5，脑心浸液18.5，山梨醇91。本专利技术中的LBHIS固体培养基是：在LBHIS培养基基础上添加1.5%-2.0%琼脂。构建的基因工程菌WY001/pDXW-8-fusA的应用，在摇瓶培养生产氨基酸。构建的基因工程菌WY001/pDXW-8-fusA的应用，在发酵罐生产氨基酸。其生产的氨基酸为L-异亮氨酸及赖氨酸。生物材料样品保藏：一株过表达fusA基因工程菌，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2014年5月28日；保藏编号：CCTCCNO：M2014233；分类命名：谷氨酸棒杆菌属乳糖发酵短杆菌亚种WY001/pDXW-8-fusA（Corynebacteriumglutamicumsubspecieslactofermentum）WY001/pDXW-8-fusA。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了能提高氨基酸产量的基因工程菌的构建方法，属于基因重组技术。该方法包括以下过程：克隆延伸因子EF-G基因fusA，利用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒表达载体构建重组质粒。将重组质粒导入谷氨酸棒杆菌中，卡那霉素抗性筛选转化子，通过PCR进一步确认。本专利技术构建的谷氨酸棒杆菌基因工程菌摇瓶发酵及发酵罐发酵均可提高氨基酸的产量，并可有利于降低分离纯化难度和提高收率，从而显著降低氨基酸生产成本。附图说明图1过表达重组载体构建流程。具体实施方式实施例1延伸因子EF-G基因工程菌的构建步骤如下：（1）设计引物扩增fusA上游引物：5’-CTAGCTAGCAGAAGGAGTAAATCGGTGGCTCAAGAAGTGCTTAAG-3’，下划线为NheI酶切位点；下游引物：5’-AACCCTCGAGTTAGGAAGCGGTGCCGTTGC-3’，下划线为XhoI酶切位点；（2）将PCR产物和表达载体pDXW-8分别用NheI/XhoI双酶切，回收后，将fusA和pDXW-8以6∶1～3∶1的摩尔比例，用T4连接酶在16℃连接2h，构建重组表达载体pDXW-8-fusA(如图1)；（3）然后将重组质粒pDXW-8-fusA导入谷氨酸棒杆菌WY001中，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LBHIS固体培养基30℃培养48h，筛选转化子；（4）提取筛选的转化子的质粒，用PCR验证转化子，从而获得过表达fusA基因的基因工程菌WY001/pDXW-8-fusA（所用验证引物同上）。实施例2过量表达EF-G基因工程菌在摇瓶培养生产氨基酸从保藏菌株WY001/pDXW-8-fusA的甘油管中划取一环菌液在固态活化培养基上划线，30℃、培养36h。利用接种环从活化好的平板上刮取一接种环菌苔转接到装有25mL种子培养基的250mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株过表达fusA基因工程菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum subspecies lactofermentum）WY001/ pDXW‑8‑fusA，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.2014233。

【技术特征摘要】
1.一株过表达fusA基因工程菌，其命名为谷氨酸棒杆菌乳糖发酵短杆菌亚种（C.glutamicumsubspecieslactofermentum）WY001/pDXW-8-fusA，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小元，赵建勋，胡晓清，李颜颜，尹良鸿，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32