利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法及应用技术

本发明专利技术公开一种利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法及应用。该方法以嗜热厌氧梭菌初级脚手架蛋白基因设计引物；设计引物对A和引物对B；使用引物A扩增得到的cipA与线性化的质粒载体连接，得到阳性质粒，用作阳性对照并与引物对B结合起来制作标准曲线，横坐标为不同模板拷贝数的对数，纵坐标为荧光定量PCR反应出现荧光信号的初始循环数Ct；抽提待测样品中嗜热厌氧梭菌的基因组，使用引物对B进行荧光定量PCR，根据标准曲线得到待测样品中的cipA基因片段拷贝浓度，即为嗜热厌氧梭菌菌体数量。该方法用于检测嗜热厌氧梭菌在不溶性底物中的生长情况，与传统方法相比，准确度高，特异性强，且操作简便。

【技术实现步骤摘要】
利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法及应用
本专利技术属于发酵和分子检测
，特别涉及一种利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法及应用。
技术介绍
嗜热厌氧梭菌(又名热纤梭菌，Clostridiumthermocellum)是一种严格嗜热厌氧的纤维素降解细菌，能够将纤维素降解形成纤维二糖和纤维糊精，其中纤维二糖可进一步被利用产生乙醇和氢气并伴随着有机酸(如乙酸、乳酸)的释放。在能够降解纤维素的嗜热厌氧梭菌中，热纤梭菌是降解纤维素速率最快的微生物之一，因此在纤维素生物降解和纤维素酒精大规模工业生产方面具有很大的应用潜力。利用这种细菌生产生物燃料具有以下优点：①发酵过程中不需要氧气；②能够降解多种复杂的碳水化合物(如淀粉、纤维素、半纤维素和胶质等)，具有高效的胞外纤维素酶系统——纤维小体，能够直接用于微生物的转化过程如联合生物过程；③细胞的产量很低，较多的底物能够转化成代谢产物如乙醇和氢气等；④最适的生长温度为55～60℃，高温既便于酒精的回收，也使污染的概率降低。在微生物培养过程中，微生物生长和产物合成的关系是研究的重点。针对嗜热厌氧菌在不溶性物底物木质纤维素中的生长测定，至今没有很好的方法。常用的微生物生长测定方法——比浊法和干重法要求培养液不含非细胞固形物，否则将造成正偏差。长期以来人们用于测定嗜热厌氧菌在不溶物底物木质纤维素中的生长的方法主要是依靠蛋白质含量来表征细胞的生长，但费时长且操作繁琐，而且只能间接表示细胞生长，并没有直接定量测出细胞浓度。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法。本专利技术的另一目的在于提供所述利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌在不溶性底物中生长状态的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法，包括如下步骤：(1)设计引物：根据GenBank中已报道的嗜热厌氧梭菌(Clostridiumthermocellum)初级脚手架蛋白基因cipA序列设计引物；设计用于扩增目的基因cipA的引物对A和用于荧光定量PCR的引物对B，引物对A和引物对B相同或不同；当引物对A和引物对B不同时，引物A扩增的片段包含引物对B扩增的片段，即引物对B扩增的片段与引物A扩增的片段的部分相同；(2)质粒标准品的建立：①基因组提取：从嗜热厌氧梭菌提取基因组；②目的基因cipA的扩增：以基因组为模板，以引物对A为PCR引物，进行PCR，得到目的基因cipA；③阳性质粒的构建：将步骤②得到的目的基因cipA与线性化的质粒载体连接，转化入宿主细胞中进行复制，筛选鉴定，得到阳性质粒；(3)标准曲线的建立：①质粒标准品中cipA基因片段拷贝数的测定：使用紫外分光光度计测定阳性质粒浓度，根据测定的核酸浓度，通过以下公式计算质粒标准品中cipA基因片段拷贝数：拷贝数(copies/μL)＝[(ng数×10-9)×(6.02×1023)]÷(碱基数×345)；碱基数为阳性质粒的碱基数；②标准曲线的制作：将已测定浓度的阳性质粒进行梯度稀释，进行荧光定量PCR，所用的引物为引物对B；以不同模板拷贝数的对数为横坐标，以荧光定量PCR反应出现荧光信号的初始循环数(Ct)为纵坐标，绘制标准曲线；(4)检测待测样品中的嗜热厌氧梭菌数量：①抽提待测样品中嗜热厌氧梭菌的基因组；②按步骤(3)②进行荧光定量PCR，其中设置阴性对照和阳性对照，阴性对照中用水代替模板，阳性对照中的模板为步骤(2)制备的阳性质粒；③将待测样品的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到待测样品中的cipA基因片段拷贝浓度，由于一个嗜热厌氧梭菌细胞只含有一个cipA基因片段的拷贝，因此计算出的cipA基因片段的初始拷贝数即为嗜热厌氧梭菌菌体数量；步骤(1)中所述的引物对A优选为引物cipA(Ord)-F和引物cipA(Ord)-R；cipA(Ord)-F：5’-GGAATTCTACAACAGCAATCC-3’；cipA(Ord)-R：5’-ATTGGATCATCTGACGGCGGT-3’；步骤(1)中所述的引物对B在设计时，选择扩增产物不超过300bp的引物对，更优选扩增产物为200～300bp的引物对；最优选为引物cipA(Q1)-F和引物cipA(Q1)-R：cipA(Q1)-F：5’-GTAACGGCAGCTACAACGGAAT-3’；cipA(Q1)-R：5’-CTTTACCCCATACAAGAACACC-3’；步骤(2)①和步骤(4)①中所述的基因组提取可通过常规的细菌基因组提取方法进行提取，也可通过细菌基因组提取试剂盒进行提取；优选通过革兰氏阳性细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取；步骤(2)②中所述的PCR的反应条件优选为：94℃1min；94℃30s、50～65℃30s、72℃40s，扩增30个循环；72℃10min；所述的PCR的扩增体系优选为：每100μL体系中各成分如下：PremixTaq50μL、引物对A中的上游引物40nmol、引物对A中的下游引物40nmol、基因组2μL，水为余量；步骤(2)③中所述的线性化的质粒载体优选为T载体；步骤(2)③中所述的宿主细胞优选为大肠杆菌宿主细胞，特别优选为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌JM109；步骤(2)③中所述的筛选鉴定可先依据所选用的质粒载体选择相应的抗生素进行初筛，再通过菌落PCR进行鉴定，最后通过测序进行阳性质粒的最后确定；步骤(3)①中所述的紫外分光光度计优选为超微量紫外分光光度计；步骤(3)②中所述的荧光定量PCR的反应条件优选为：95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s；后半部分(划横线部分)用于分析扩增产物的熔点曲线，通过熔解峰是否单一判断产物的特异性；所述的荧光定量PCR的扩增体系优选为：2倍浓度(2×)的PremixExTaqII(TliRNaseHPlus)10μL，引物对B中的上游引物(10mM)和下游引物(10mM)各0.8μL，50倍(50×)浓度染料ROXReferenceDyeII0.4μL，模板2μL，去离子水6补足至20μL；所述利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法可用于检测嗜热厌氧梭菌的菌体数量，从而适合用于检测嗜热厌氧梭菌在不溶性底物中的生长情况；一种利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌在不溶性底物中生长状态的方法，包括如下步骤：(1)在不溶性底物中培养嗜热厌氧梭菌；(2)取样，按照上述利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法进行检测；(3)根据检测结果，得到嗜热厌氧梭菌在不溶性底物中生长状态的数据；所述利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌在不溶性底物中生长状态的方法可用于评价不同不溶性底物的可降解性能。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术建立了灵敏度高、特异性强、操作简单的热纤梭菌荧光定量PCR检测方法，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，及时确定微生物生长变化规律，客观评价培养条件和营养物质对微生物生长的影响，无论是对科学研究还是对工业化生产都有重要的意义。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计引物：根据GenBank中已报道的嗜热厌氧梭菌(Clostridium thermocellum)初级脚手架蛋白基因cipA序列设计引物；设计用于扩增目的基因cipA的引物对A和用于荧光定量PCR的引物对B，引物对A和引物对B相同或不同；当引物对A和引物对B不同时，引物A扩增的片段包含引物对B扩增的片段；(2)质粒标准品的建立：①基因组提取：从嗜热厌氧梭菌提取基因组；②目的基因cipA的扩增：以基因组为模板，以引物对A为PCR引物，进行PCR，得到目的基因cipA；③阳性质粒的构建：将步骤②得到的目的基因cipA与线性化的质粒载体连接，转化入宿主细胞中进行复制，筛选鉴定，得到阳性质粒；(3)标准曲线的建立：①质粒标准品中cipA基因片段拷贝数的测定：使用紫外分光光度计测定阳性质粒浓度，根据测定的核酸浓度，通过以下公式计算质粒标准品中cipA基因片段拷贝数：拷贝数/μL＝[(ng数×10‑9)×(6.02×1023)]÷(碱基数×345)；碱基数为阳性质粒的碱基数；②标准曲线的制作：将已测定浓度的阳性质粒进行梯度稀释，进行荧光定量PCR，所用的引物为引物对B；以不同模板拷贝数的对数为横坐标，以荧光定量PCR反应出现荧光信号的初始循环数Ct为纵坐标，绘制标准曲线；(4)检测待测样品中的嗜热厌氧梭菌数量：①抽提待测样品中嗜热厌氧梭菌的基因组；②按步骤(3)②进行荧光定量PCR，其中设置阴性对照和阳性对照，阴性对照中用水代替模板，阳性对照中的模板为步骤(2)制备的阳性质粒；③将待测样品的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到待测样品中的cipA基因片段拷贝浓度，计算出的cipA基因片段的初始拷贝数即为嗜热厌氧梭菌菌体数量。...

【技术特征摘要】
1.一种利用实时荧光定量PCR检测嗜热厌氧梭菌的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计引物：根据GenBank中已报道的嗜热厌氧梭菌(Clostridiumthermocellum)初级脚手架蛋白基因cipA序列设计引物；设计用于扩增目的基因cipA的引物对A和用于荧光定量PCR的引物对B；(2)质粒标准品的建立：①基因组提取：从嗜热厌氧梭菌提取基因组；②目的基因cipA的扩增：以基因组为模板，以引物对A为PCR引物，进行PCR，得到目的基因cipA；③阳性质粒的构建：将步骤②得到的目的基因cipA与线性化的质粒载体连接，转化入宿主细胞中进行复制，筛选鉴定，得到阳性质粒；(3)标准曲线的建立：①质粒标准品中cipA基因片段拷贝数的测定：使用紫外分光光度计测定阳性质粒浓度，根据测定的核酸浓度，通过以下公式计算质粒标准品中cipA基因片段拷贝数：拷贝数/μL＝[(ng数×10-9)×(6.02×1023)]÷(碱基数×345)；碱基数为阳性质粒的碱基数；②标准曲线的制作：将已测定浓度的阳性质粒进行梯度稀释，进行荧光定量PCR，所用的引物为引物对B；以不同模板拷贝数的对数为横坐标，以荧光定量PCR反应出现荧光信号的初始循环数Ct为纵坐标，绘制标准曲线；(4)检测待测样品中的嗜热厌氧梭菌数量：①抽提待测样品中嗜热厌氧梭菌的基因组；②按步骤(3)②进行荧光定量PCR，其中设置阴性对照和阳性对照，阴性对照中用水代替模板，阳性对照中的模板为步骤(2)制备的阳性质粒；③将待测样品的循环阈值Ct与标准曲线对照，得到待测样品中的cipA基因片段拷贝浓度，计算出的cipA基因片段的初始拷贝数即为嗜热厌氧梭菌菌体数量；步骤(1)中所述的引物对A为引物cipA(Ord)-F和引物cipA(Ord)-R；cipA(Ord)-F：5’-GGAATTCTACAACAGCAATCC-3’；cipA(Ord)-R：5’-ATTGGATCATCTGACGGCGGT-3’；步骤(1)中所述的引物对B为引物cipA(Q1)-F和引物cipA(Q1)-R：cipA(Q1)-F：5’-GTAACGGCAGCTACAACGGAAT-3’；cipA(Q1)-R：5’-CTTTACCCCATACAAGAACACC-3’。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱明军，汤虹，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44