本发明专利技术出人意料地显示，在GPCR的氨基末端加入源自异源病毒-GPCR(G蛋白偶联受体)的序列改善真核细胞中此种受体的细胞表面表达。在其表面表达上述异源病毒GPCR的转染的细胞用于基于细胞的测定以鉴定增加或调节GPCR或GPCR配体的活性的测试化合物，例如用于药物发现，食品工业中新的味道的开发或基于气味GPCR的传感器的开发。此外，源自转染的细胞的膜提取物可以被用于例如药物发现中的化合物测定或用于开发包含此种膜提取物的传感器以鉴定和/或定量挥发性有机化合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改善的细胞表面表达的GPCR 专利
本专利技术可以包括在生物技术和制药领域。本专利技术显示在GPCR的氨基末端添加源 自病毒_GPCR(G蛋白偶联受体）的序列改善真核细胞中此种受体的细胞表面表达。通过此 种源自异源病毒-GPCR序列对细胞表面表达的此种改善可以在原代或建立的细胞系（例如 哺乳动物的造血或非造血细胞系）和在稳定转染或瞬时转染的细胞中完成。可以将此种异 源序列与信号肽和/或肽标签联合用于表面检测和/或分离GPCR阳性细胞。此外，用于表 达至少包含源自异源病毒-GPCR的序列的GPCR的有用的启动子可以选自非沉默组成型启 动子或诱导型启动子。 在其表面表达上述异源病毒-GPCR的转染的细胞用于基于细胞的测定以鉴定增 加或调节GPCR或GPCR配体的活性的测试/候选化合物，例如用于药物发现，食品工业中新 的味道的开发或基于气味GPCR的传感器的开发。此外，源自转染的细胞的膜提取物可以用 于例如药物发现中的化合物测定或用于开发包含此种膜提取物的传感器以鉴定和/或定 量挥发性有机化合物。 现有技术 对于配体的细胞表面受体是分子实体，通过该分子实体，细胞感受其周围环境。配 体-受体相互作用之后，细胞引导响应于此相互作用的细胞进程。GPCR，也被称为七跨膜受 体，包含已经鉴定的细胞表面受体的最大家族。超过60%的当前的处方药靶向GPCR，并因 此，GPCR是用于药物发现研究的最重要的靶点之一。至今，约400种基因已被鉴定为GPCR。 并且，GPCR也是用于感受气味和味道的受体。 GPCR通过类似的分子机制运转。通过胞外刺激激活GPCR引起受体中的构象改变， 其导致中间偶合（intermediate coupling)和GTP-结合蛋白（G蛋白）的激活。性质上G 蛋白是异源三聚的并且由不同基因编码的α，β，和Y亚基组成。所述α亚基负责⑶P和 GTP的结合。配体对GPCR的结合导致α亚基从⑶Ρ-结合形式到GTP-结合形式的转变并 导致通过α-GTP从β γ二聚体解离激活异源三聚体。α-GTP和β γ二聚体二者都调节 多种通过产生第二信使分子（例如，钙，cAMP，等）向细胞内传递信号的效应物的活性。存 在至少17种Ga基因，并且可以将G蛋白的成员分为四种主要类型，所述四种主要类型被称 为G a i/Q，G a q，G α 15和G α 12。基于结合GPCR的配体可以与多种G蛋白偶联，因此导致激 活很多复杂的信号传导通路，其能够使对于GPCR的高通量筛选（HTS)读出复杂化。 配体对特定GPCR的结合起始信号，所述信号可以通过测量信号传导通路的一些 元件（主要是第二信使，如细胞内钙，环AMP和磷酸肌醇代谢产物）的性质的一些改变被检 测。对简单性和对无已知配体的受体的脱孤（deorphanization)二者而言，对大多数GPCR 通用的读出对药物发现是有用的。在现有技术中已知某些内源的混杂的G-蛋白可以与很 多 GPCR 偶联[Wilkie TM，Scherle PA，Strathman MP，Slepak VZ 和 Simon Ml.Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 :10049-10053(1991)]和[Amatruda TT.，Steele DA.，SI印ak VZ.和 Simon MI. Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 :5587-5591 (1991)]，但此种内源的混杂的 G-蛋白仅在某 些造血细胞（如人中的髓单核细胞和T细胞和小鼠和大鼠中的髓单核细胞，B细胞和某些T 细胞）中天然表达。但大多数GPCR的表达在大多数造血细胞中难以获得。 备选方案是将GPCR和混杂的G-蛋白偶联受体二者共转染入非造血细胞，但还有 为了改善的灵敏度在此种细胞系中以高水平表达GPCR的需求。另外，一些研究者想使用原 代细胞用于筛选，但那些细胞通常表达低水平的GPCR并且因此，灵敏度低。备选方案可以 是将靶GPCR转染入此种原代细胞以改善灵敏度，同时保持细胞背景尽可能接近目标疾病 的细胞背景。但是原代细胞难以转染，它们不能长时间在体外培养并且因此它们不能被稳 定转染。因此，对于非造血细胞和原代细胞二者，都需要对于GPCR表达改善的方法。 -种筛选GPCR药物靶点的常见技术是以高通量的方式测量当配体结合于GPCR时 细胞内钙的变化。然而，不是所有GPCR偶联于G a q导致钙动员。 现有技术已知，造血细胞以高水平表达内源的混杂的G-蛋白（比如6〇15和/或 Ga16) [Wilkie TM, Scherle PA, Strathman MP, Slepak VZ 和 Simon Ml.Proc. Natl. Acad. Sci.USA88 :10049-10053(1991)]和[Amatruda TT·， Steele DA. ， Slepak VZ.和 Simon MI. Proc. Natl. Acad. Sci.USA88 :5587-5591(1991)];其全部教导通过引用并入本文。不幸 的是，很多GPCR难以在细胞表面，尤其在造血细胞表面以高水平表达。 -种用于将非-G α ,偶联的受体偶联于钙通路的备选方法是将混杂的G蛋白（例 如Ga15)或GaqR合体之一共转染以将GPCR激活与钙动员联系起来。在该方法中，还有 在细胞表面上以用于筛选的足够水平表达GPCR的需求。 另外，有时需要使用原代细胞系用于筛选药物，尤其使用尽可能接近于开发药物 所针对的目标疾病的细胞类型的细胞系。对于原代细胞，细胞表面上内源GPCR的水平低， 并且因此用原代细胞仅鉴定高亲和力的结合剂。但是原代细胞系难以被转染并且它们不能 长时间培养并且因此稳定的转染通常是不可能的。 GPCR也是介导气味识别的嗅球中表达的受体。人在其嗅球上表达约400种功能性 GPCR并且啮齿动物表达约1000种功能性GPCR。但是异源细胞表面上GPCR的表达非常低。 用以改善在异源细胞表面上嗅觉的GPCR的细胞表面表达的策略中的一种是单独或与源自 视紫红质受体的N-末端序列一起使用分子伴侣如RTP1S和REEP。需要改善细胞表面表达 的新序列。 现有技术中公知，糖基化是七跨膜G-蛋白偶联受体（GPCR)的常见翻译后修饰。现 有技术中已知糖基化的两种常见形式：N-连接的糖基化和0-连接的糖基化。N-连接的糖 基化是天冬氨酸或精氨酸侧链的寡糖修饰的过程并且对于一些真核蛋白的折叠重要。N-连 接的糖基化通常发生在真核生物内质网腔中。〇-连接的糖基化涉及通过N-乙酰半乳糖胺 连接于丝氨酸或苏氨酸的羟基侧链的多糖。〇-连接的糖基化发生在高尔基体中。 尽管已经显示糖基化对于蛋白折叠，受体向细胞表面的运输和靶向是重要的，对 GPCR表面表达相关的糖基化的实例限于N-连接的糖基化。实际上，关于GPCR中的0-连 接的糖基化，没有现有技术。因此，目前，不知道〇-连接的糖基化是否改善GPCR的表面表 达或在GPCR的氨基末端添加异源序列是否产生0-连接的糖基化和此种潜在的糖基化对于 GPCR的表面表达的效果。 已经在具有蛋白0-糖基化的可逆缺陷的突变的中国仓鼠卵巢（CH0)细胞系 中研究白细胞介素-2(IL-2)本文档来自技高网...
【技术保护点】
编码源自异源‑病毒GPCR的序列的核酸序列用于改善真核细胞表面中真核受体GPCR的体外表达的用途。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1. 编码源自异源-病毒GPCR的序列的核酸序列用于改善真核细胞表面中真核受体 GPCR的体外表达的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述真核受体GPCR在真核细胞中体外过量表达。3. 根据权利要求1或2任一项所述的用途，其中所述编码源自异源-病毒GPCR的序 列的核酸序列特征在于：包含由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2表示的DNA序列或编码包含 SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :9的氨基酸序列的DNA序列。4. 编码源自异源-病毒受体GPCR的序列的分离的核酸序列，其特征在于包含由SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2表示的核酸，或其特征在于包含编码包含SEQ ID N0:8或SEQ ID NO :9的氨基酸序列的核酸。5. 编码真核受体GPCR的核酸序列，所述编码核酸序列特征在于：进一步包含编码源自 异源-病毒GPCR的序列的核酸序列的至少部分。6. 根据权利要求5所述的核酸序列，其中编码源自异源-病毒GPCR的序列的所述序列 的部分特征在于包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2,或特征在于包含编码包含SEQ ID NO : 8或SEQ ID NO :9的氨基酸序列的片段。7. 根据权利要求5至6任一项所述的核酸序列，所述核酸序列进一步包含用于改善表 面表达的信号肽和/或用于表面检测和/或分离阳性表达异源-病毒GPCR序列的细胞的 序列标签。8. 根据权利要求5至7任一项所述的核酸序列，所述核酸序列进一步包含启动子。9. 根据权利要求8所述的核酸序列，所述核酸序列包含诱导型启动子。10. 根据权利要求9所述的核酸序列，所述核酸序列包含选自：蜕皮激素诱导型启动 子，cumate诱导型启动子和孕酮诱导型启动子的诱导型启动子。11. 根据权利要求8所述的核酸序列，所述核酸序列包含组成型启动子。12. 根据权利要求11所述的核酸序列，所述核酸序列包含选自序列：SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 的组成型启动子。13. 表达载体，优选质粒，其包含权利要求4至12所述的核酸序列。14. 根据权利要求13所述的表达载体，其特征在于所述表达载体包含SEQ ...
【专利技术属性】
技术研发人员：埃利耶·帕斯罗哈斯，费·伊莎贝尔·加西亚马塞拉，韦罗妮卡·马库拉达·卢纳格雷罗，马里亚·格拉西亚·蒙特罗佩尼亚尔沃，塔尼亚·加西亚马塞拉，何塞·安德列斯·莫拉莱斯马丁内斯，安娜·贝伦·阿拉贡戈麦斯，安娜·克萨达莫利纳，奥罗拉·玛丽亚·马克斯莫拉莱斯，
申请(专利权)人：坎瓦克斯生物技术公司，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES
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