本发明专利技术采用RT-PCR方法获得黄鳝性腺中ERα序列，选择其抗原性较强的氨基酸序列相对应的cDNA序列作为模板克隆到长约945bp的序列，并将其克隆到pMAL-c2x表达载体中，通过IPTG诱导，Amylose-sepharose柱的纯化，获得了较纯的具有免疫活性的重组蛋白，采用FactorXa蛋白酶切、进一步纯化后，获得了可作为免疫原的ERα表达蛋白。免疫小鼠后，获得较高滴度的抗血清，并初步进行了免疫组化研究，表明该抗血清能特异与黄鳝性腺中的ERα蛋白结合，在卵母细胞膜上呈阳性反应，为进一步研究黄鳝性别发展中雌激素及其ERα等作用打下了基础。本发明专利技术还以此抗体为基础制备了ELISA检测试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术采用RT-PCR方法获得黄鳝性腺中ERα序列，选择其抗原性较强的氨基酸序列相对应的cDNA序列作为模板克隆到长约945bp的序列，并将其克隆到pMAL-c2x表达载体中，通过IPTG诱导，Amylose-sepharose柱的纯化，获得了较纯的具有免疫活性的重组蛋白，采用FactorXa蛋白酶切、进一步纯化后，获得了可作为免疫原的ERα表达蛋白。免疫小鼠后，获得较高滴度的抗血清，并初步进行了免疫组化研究，表明该抗血清能特异与黄鳝性腺中的ERα蛋白结合，在卵母细胞膜上呈阳性反应，为进一步研究黄鳝性别发展中雌激素及其ERα等作用打下了基础。本专利技术还以此抗体为基础制备了ELISA检测试剂盒。【专利说明】
本专利技术涉及基因工程领域，具体是涉及。
技术介绍
黄鳝，又名鳝鱼,主要生活在亚洲地区，目前中国只有I种，具有较高的营养价值。自从七十年代开始人工养殖以来，野生黄鳝苗种便被大量捕捉，同时环境污染等造成黄鳝野生资源日渐减少，养殖苗种严重短缺。黄鳝发育周期中存在性逆转的现象，开始发育时黄鳝为雌性，性成熟产卵后，雄性生殖细胞开始发育，形成间性阶段，逐渐发育成雄性黄鳝。黄鳝发育周期中性逆转的现象是刘健康等首先发现的(刘健康，顾国彦.鳝鱼性逆转时生殖腺组织的改变，水生生物学报，1951，2 (1-2):85-109)，而后肖亚梅(肖亚梅，刘筠.黄鳝由间性发育转变为雄性发育的细胞生物学研究.水产学报，1995，19(4):297-301 ;肖亚梅.黄鳝繁殖生物学研究:1.黄鳝的雌性发育.湖南师范大学自然科学学报.1995，18(4):45-52)等详细的研究了黄鳝性腺发生与分化的过程，从而表明黄鳝开始发育时为雌性，雌性性成熟产卵后，性腺内卵细胞逐步败育，卵巢结构退化，同时雄性生殖细胞开始发育，形成间性阶段，通过这一阶段黄鳝过渡到雄性发育，最后形成雄性的黄鳝。黄鳝性别决定基因或在基因水平上调控黄鳝性逆转一直以来都是研究者们关注的热点，而性别决定又是一个涉及多基因不同时空的复杂调控过程。性类固醇激素(sex steroid hormone)是调节脊椎动物下丘脑-垂体-性腺轴的发育成熟及维持各项功能的重要激素。动物体内内源性类固醇激素主要有雄激素、雌激素和孕激素三种，它们的生理功能主要都是通过经典的雌激素核受体介导的。雌激素受体与雌激素特异性地结合后介导雌激素应答元件(estrogen respond elements,EREs)调节基因的转录。硬骨鱼类的ER种类和生理功能等似乎比高等脊椎动物更为复杂。首个鱼类ER α是由Pakdel等从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脑中分离得到的,迄今为止,有10余种鱼类的ERa已进行了研究报道。激素的酶联免疫测定具有无放射性污染，标记物稳定，标记酶来源广泛、经济，灵敏度、特异性与放免测定相当等特点，使得激素的酶免测定方法有望替代放免测定技术。但酶联免疫测定需要较多的激素标准品，用常规的垂体抽提技术需要大量的垂体。
技术实现思路
本专利技术提供了黄鳝雌激素受体α蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。编码上述蛋白质的黄鳝雌激素受体α基因。所述的黄鳝雌激素受体α基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。本专利技术还提供了含有上述黄鳝雌激素受体α基因的载体。上述的载体，是指在EcoR I和Hind III位点之间插入上述黄鳝雌激素受体α基因的 pMAL。本专利技术还提供了用于黄鳝雌激素受体α基因的酶联免疫检测方法，包括如下步骤: (1)抗原的制备:将黄鳝雌激素受体α基因插入载体中，并在大肠杆菌中表达，得到的ERa重组蛋白，经纯化后作为抗原； (2)抗体的制备:将(I)中所得到的抗原免疫鼠制备得到抗黄鳝雌激素受体α抗体； (3)抗体的纯化:对(2)中所得的抗体经离心、沉淀、脱盐，得纯化抗体； (4)纯化抗体的标记:用酶标记(3)中所得的纯化抗体，得到酶标抗体； (5)标准曲线的绘制:用不同浓度的抗原包被在固相载体上，通过与(4)中所获得的酶标抗体结合后，进行测定，绘制抗原浓度与OD值的标准曲线； (6)样本测定:对待测样本进行测定，通过标准曲线得出待测样本中抗原的含量。进一步地，步骤(1)中是通过将黄鳝雌激素受体α基因插入至pMAL_c2x的EcoR1、Hind III的位点之间，转化大肠杆菌TBl，获得融合蛋白；再对融合蛋白的MBP蛋白酶切后，得到ER α重组蛋白。进一步地，所述的步骤(4)中，所用的酶为辣根过氧化物酶。本专利技术还提供了黄鳝雌激素受体α的酶联免疫检测试剂盒，包括有上述的黄鳝雌激素受体α蛋白质及其对应的抗体，所述的抗体是通过黄鳝雌激素受体α蛋白质在小鼠免疫反应制备得到。本专利技术还提供了黄鳝雌激素受体α基因在黄鳝ERa受体检测中的应用。有益效果 本试验采用RT-PCR方法获得黄鳝性腺中ERa序列，选择其抗原性较强的氨基酸序列相对应的cDNA序列作为模板克隆到长约945 bp的序列，并将其克隆到pMAL_c2x表达载体中，通过IPTG诱导，Amylose-sepharose柱的纯化,获得了较纯的具有免疫活性的重组蛋白，采用Factor Xa蛋白酶切、进一步纯化后，获得了可作为免疫原的ER α表达蛋白。免疫小鼠后，获得较高滴度的抗血清，并初步进行了免疫组化研究，表明该抗血清能特异与黄鳝性腺中的ERa蛋白结合，在卵母细胞膜上呈阳性反应，为进一步研究黄鳝性别发展中雌激素及其ERa等作用打下了基础。本专利技术还以此抗体为基础制备了 ELISA检测试剂盒。【专利附图】【附图说明】 图1是RT-PCR产物琼脂糖电泳图，M泳道是marker，I泳道是RT-PCR产物； 图2是重组质粒pMAL-ER α的限制性酶切分析中的电泳图，M泳道是marker，I泳道是PMD18-T-ER α 经 EcoRI 和 Hind III双酶切产物； 图3是鉴定大肠杆菌中ERa融合蛋白的SDS-PAGE分析的电泳图，I泳道是E.coliTBl; 2-3 泳道:TBl/pMAL 分别经(λ 3M、IM IPTG 诱导 4h ； 4 泳道:TBl/pMAL-ER α 经 0.3MIPTG 诱导 4h。图4是蛋白免疫印迹试验中的电泳图，M泳道是marker ；1泳道是TBl/pMAL诱导表达的MBP蛋白2泳道是TBl/pMAL-ER α诱导表达的重组蛋白；3泳道诱导的TBl裂解物。图5是小鼠免疫ER α和生理盐水后的抗体滴度分布 图6Α~图6D是鼠抗ERa多克隆抗体进行黄鳝性腺免疫组化分析，其中，图6Α:卵巢、图6Β:卵巢对照、图6C:精巢、图6D:精巢对照(图中，O:卵，GF:生殖褶，SP:精小囊) 图7Α是ERa在黄鳝性腺组织中的基因蛋白水平表达的western blot分析结果；横坐标:1卵巢.2.精巢；纵坐标:基因与对应β -actin的灰度比值 图7B是ERa在黄鳝性腺组织中的蛋白表达半定量分析结果；I卵巢.2.精巢； 图8是试剂盒线性验证的线性关系图。【具体实施方式】下面通过【具体实施方式】结合附图对本专利技术作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例 仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件本文档来自技高网...
【技术保护点】
黄鳝雌激素受体α蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁炜东，邴旭文，曹丽萍，曹哲明，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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