感光嵌合GPCR蛋白制造技术

提供一种包含来自G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白超家族的至少两个成员的结构域的感光嵌合蛋白用于医学疗法和用于制备用于改善视力、特别用于治疗由视网膜光感受器变性引起的视力丧失的药物，所述结构域融合在一起以产生能够使光信号与代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)的信号转导级联偶联的感光GPCR嵌合体。至少两个GPCR家族成员的第一个促成介导对嵌合感光GPCR蛋白的感光性的结构域。该第一成员属于感光GPCR蛋白家族亦称感光色素，并且在一些实施方案中，这种感光GPCR蛋白是黑视蛋白，特别是人黑视蛋白。至少两个GPCR家族成员的第二个是mGluR6，其促成使光信号与mGluR6的胞内信号转导级联偶联的结构域，所述mGluR6是内视网膜中ON-双极细胞的细胞膜的天然组分。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】感光嵌合GPCR蛋白专利
本专利技术在于用于治疗患有视力丧失的人或动物患者的医学治疗学和医学疗法领域，并且涉及用于用感光嵌合GPCR蛋白改善视力、特别用于治疗由视网膜光感受器变性引起的视力丧失的治疗法以及用于所述改善的药物的制备。专利技术背景视网膜光感受器变性的主要原因包括色素性视网膜炎(RP)、年龄相关性黄斑变性(ARMD)、糖尿病性视网膜病和其它疾病。大约3000人中有一人，即全球有300万人患有色素性视网膜炎(RP)，一种导致光感受器变性和最终失明的遗传病况。光感受器变性的速率(rate)和严重程度是可变的，高度取决于突变本身。超过50个基因可受到影响(Hartong等，Lancet368:1795-1809;2006)。迄今，对于RP患者几乎没有可用的治疗。正在进行中的专注于神经保护剂(例如睫状神经营养因子)或基因添加疗法(geneadditiontherapy)(引入“非突变的”基因)的试验，迄今为止仅显示有限的成功，这些试验的目的在于将获得性或遗传性基因缺陷纠正成为天然的功能基因。考虑到成体视网膜在光感受器丧失后没有产生新光感受器的能力，因此基因添加疗法只有光感受器丧失少时才是有用的，并且主要减缓或稳定早期病况。应用于最近实验性研究的备选方法是通过感光蛋白质的转基因表达赋予其余光感受器感光性或使内视网膜神经元感光性继续保持。在US2009/0088399和US2010/0015095中，提出了将光门控海藻离子通道通道视紫红质-2(light-gatedalgalion-channelchannelrhodopsin-2，ChR2)引入患有光感受器细胞变性的患者的内视网膜。这就赋予了天然光不敏感的内视网膜细胞(例如双极细胞或无长突细胞)感光性并且能够检测视觉信息，所述视觉信息随后传送到大脑而无需接收来自光感受器的输入。类似地，在US2005/0208022和US2009/0208462中，提出了将一种感光蛋白(photoreceptiveprotein)例如视蛋白(包括黑视蛋白(melanopsin))或细胞色素引入内视网膜神经元中，包括患有光感受器变性的患者的无长突细胞、水平细胞和双极细胞。在内视网膜神经元中表达ChR2的方法具有可观的前景，目前在非人灵长类动物(FradotM等，HumanGeneTherapy22(5)，587-593;2011)和分离的人视网膜(IvanovaE等，OpthalmolVisSci51(10)，5288-5296，2010)中进行试验，这为不久的将来的临床试验增加了希望。近年来，使用重组腺伴随病毒(rAAV)的视网膜基因置换疗法已获成功，并且已达到最后的临床试验。具体地讲，Bainbridge及同事使用rAAV置换缺陷型视网膜色素上皮特异性65-kDa蛋白质基因(RPE65)。RPE65蛋白的缺乏使得光感受器不能够对光起反应，因为需要其进行生色团再循环，即全反式视黄醛向11-顺式视黄醛转化(BainbridgeJWB等，NEnglJMed358(21)，2231-2239;2008)。因此，基因疗法是一种通过将合适的基因引入视网膜神经元来纠正视觉缺陷的有前景的治疗方法。然而，目前可利用的可用于基因疗法以补偿光感受器细胞丧失的光可激活蛋白(light-activatable)仍有许多实质性缺点：1)外来的无脊椎动物或藻类蛋白质(例如ChR2)的人工表达可引发患者中的不可预测的免疫反应。2)ChR2对于钙具有相对高的通透性，这在长时间内将会是有毒的。3)ChR2反应在自然光强度下本来就弱，因为每个俘获的光子只能激活单个蛋白质。4)虽然黑视蛋白能够通过门控高通量酶促反应的活性来放大光信号，但是在内视网膜神经元中无法充分获得这些酶的配偶体。因此，神经节细胞和ON-双极细胞中黑视蛋白的表达不引起足以恢复自然光强度下的功能视觉的光信号放大。5)此外，在表达外源蛋白质时，缺乏通过更新(turnover)和调节的改变而自然控制蛋白质活性的调节机制。本专利技术的目的是提供感光嵌合蛋白，所述感光嵌合蛋白当在内视网膜神经元中表达时，将克服这些缺点。也就是说，本专利技术的目的是提供用于改善和恢复视力(特别是视网膜光感受器变性患者的视力)的优良感光蛋白。与通过现有技术水平所给出的蛋白质可获得的感光性相比，这种嵌合蛋白将改善或恢复感光性至较高程度。本专利技术的其它目的包括编码嵌合感光蛋白的遗传信息和在活的细胞和生物体中表达这种嵌合蛋白的方法。本专利技术的更多目的包括在体内的内视网膜细胞中表达编码嵌合感光蛋白的遗传信息用于治疗性治疗及包含感光蛋白或编码所述嵌合蛋白的遗传信息的生物医学制品。专利技术概述该技术问题通过包含来自G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白超家族的至少两个成员的结构域的感光嵌合蛋白得到解决，所述结构域融合在一起产生感光GPCR嵌合体，其能够将光信号与代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)的信号转导级联偶联。G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白超家族成员是将信号从细胞表面传送至胞内效应物的跨膜蛋白受体。它们具有一定结构，其通常包含7个跨膜结构域(TM1-TM7)、3个胞外环(EL1-EL3)、3个胞内环(IL1-IL3)、1个胞外N端结构域(NT)和1个胞内C端(CT)结构域。GPCR蛋白超家族包括称为感光色素的感光受体蛋白，例如视蛋白，例如视紫红质和黑视蛋白。GPCR超家族还包括配体门控性代谢型受体，例如mGluR6。代谢型G蛋白偶联受体通过由特异性G蛋白介导的信号转导级联与膜中的离子通道间接连接以实现信号放大。也就是说，活化G蛋白调节酶(例如腺苷酸环化酶)的活性，所述酶快速产生大量产物(例如cAMP)，产物继而可激活细胞膜中的大量离子通道。与这种代谢型GPCR形成对比，离子型受体与膜中的离子通道直接连接。因此，离子型受体如通道视紫红质不能够像代谢型受体一样放大信号。本专利技术的一个方面涉及嵌合GPCR蛋白，其包含来源于至少两个GPCR家族成员的结构域：至少两个GPCR家族成员的第一个促成介导嵌合感光GPCR蛋白的感光性的结构域。所述第一成员属于感光GPCR蛋白家族，亦称感光色素，并且在一些实施方案中，这种感光GPCR蛋白是黑视蛋白(melanopsin)，特别是人黑视蛋白。至少两个GPCR家族成员的第二个，即mGluR6，促成使光信号与mGluR6的胞内信号转导级联偶联的结构域。mGluR6是内视网膜中ON-双极细胞的细胞膜的天然组分。对于本专利技术的治疗方面，这些ON-双极细胞是感光嵌合GPCR蛋白可在其中表达的靶细胞。在生理学上，天然ON-双极细胞mGluR6在胞外结合谷氨酸时激活其胞内信号级联。因此，ON双极细胞天然含有介导mGluR6信号转导级联的特异性胞内组分。在生理光信号转导途径中，光激活的健康视杆和视锥光感受器细胞响应光强度的降低，其中从其突触末端释放的谷氨酸水平增加，谷氨酸然后与ON-双极细胞上的mGluR6结合，这继而通过mGluR6的特异性G蛋白偶联的胞内信号转导级联引起光信号放大。与这种天然途径类似，在光激活时，失明视网膜的ON-双极细胞中表达的嵌合感光GPCR蛋白将光信号传送至依旧存在(KrižajD等，VisionRes.50:2460-65，2010)的mGluR6受体本文档来自技高网...

【技术保护点】
适于使光信号与内视网膜ON双极细胞中的mGluR6的信号转导级联偶联的嵌合GPCR蛋白，其包含来源于G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白家族的至少两个成员的结构域，其特征在于至少两个成员的第一个是促成其介导光激活的结构域中至少一些的感光GPCR，以及至少两个GPCR家族成员的第二个促成其能够使光激活与mGluR6的信号转导级联偶联的结构域中的至少一些。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.24 US 61/500,8631.一种嵌合GPCR蛋白，所述嵌合GPCR蛋白适于使光信号与内视网膜ON双极细胞中的mGluR6的信号转导级联偶联，所述嵌合GPCR蛋白包含来源于G蛋白偶联受体(GPCR)蛋白家族的两个成员的结构域，其特征在于两个成员的第一个是提供这样的结构域的双稳态感光GPCR，所述结构域介导光激活并且含有形成席夫碱的氨基酸残基，所述席夫碱共价结合生色团，以及其特征在于两个GPCR家族成员的第二个是mGluR6，所述mGluR6提供至少一个能够结合mGluR6的信号转导级联的Gα(o)蛋白的胞内结构域，其中衍生自mGluR6的所述至少一个胞内结构域包含IL2、IL3和C-端。2.权利要求1的嵌合GPCR蛋白，其中所述第一GPCR成员提供在生理学对应物中形成生色团结合袋的所有结构域。3.权利要求1的嵌合GPCR蛋白，其中所述第一GPCR成员是黑视蛋白。4.权利要求1-3中任一项的嵌合GPCR蛋白，其中衍生自mGluR6的所述至少一个胞内结构域由IL1、IL2、IL3和C...

【专利技术属性】
技术研发人员：M范维克，S克莱恩洛格，
申请(专利权)人：哈格斯特莱特医疗科技股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH