免疫佐剂大豆皂苷Ab亲脂性苯乙胺衍生物的制备方法技术

本发明专利技术涉及免疫佐剂大豆皂苷Ab亲脂性苯乙胺衍生物的制备方法，采用以下步骤：以高纯度大豆皂苷Ab为原料，溶于吡啶，先后加入碳二亚胺试剂和苯乙胺，加水终止反应过夜后，经加乙酸乙酯振荡器间歇振摇，转至分液漏斗静置过夜，得到反应混合物；取乙酸乙酯层，检测目标产物及目标产物分子量；采用制备型液相色谱分离得到苯乙胺修饰的亲脂性衍生物AbD。与现有技术相比，本发明专利技术制备了高纯度修饰物AbD，目标产物分子量为1539，产率为5.40％，溶血率低，对小鼠脾脏淋巴细胞的体外免疫有增强作用，同时提高了OVA免疫小鼠血清中四种特异性抗体的水平。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药生物技术，尤其是涉及一种。
技术介绍
皂苷(Saponins) —词最早来源于拉丁语“sapo”，又名皂甙、皂素。从化学结构上看，皂苷是由苷元骨架与糖基，通过糖苷键相连构成的糖苷类化合物。根据苷元和糖基侧链位置的不同，大豆皂苷可被分为四大类:A、B、E和DDMP族。随着近年来对大豆皂苷各种组分及化学结构的认识逐步加深，特别是DDMP结合皂苷的发现，使得大豆皂苷的研究取得了很大的进展。国内外学者通过对大豆皂苷的生物学、生理学和药学的活性试验都证明，大豆皂苷对人体无毒害作用，而且还有许多有益的生理功效，由于组成大豆皂苷的苷元和多聚糖的种类不同，大豆皂苷具有多种生物学和药学特性，如抑制癌细胞生长、增强免疫能力、抗病毒、抗氧化、降血脂血糖等。近年来，随着科学技术的发展，人们在研究中观察到了皂苷的糖链与其生物活性之间的密切关系，对糖链的修饰和改造也逐渐成为研究的热点。对活性天然产物结构改造或优化研究中，一般只在其取代基或侧链进行衍生化，如烷基化、酰化、氧化、还原等。对大豆皂苷而言，可在糖链上进行取代基或衍生化的反应，加入亲脂或亲水性的基团，改变其极性的大小。对皂苷糖链的修饰方法归纳起来主要有化学法和酶法。研究发现，多糖分子上的某些羟基被硫酸根取代后形成的硫酸化多糖有更好的抗病毒、抗肿瘤、提高机体免疫功能的活性。除此之外，皂苷中的糖链经过衍生化如乙酰化、甲基化、硫酸化等也能显著的影响阜苷的生物活性。Daniela等对积雪草阜苷的酶法修饰做了深刻的研究。他利用脂肪酶NOVOZym435催化糖类羟基与乙酸乙烯酯的反应，将糖类酰化；用漆酶Laccases结合TEMPO (电子介导剂)将葡萄糖和半乳糖上的伯羟基氧化成羧基；利用β-1，4-半乳糖基转移酶(i3-l，4-GalT)将半乳糖苷基团从UDP-半乳糖苷转移到N-多糖复合物的末端N-乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖上，形成β-1，4糖苷键；还用β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)催化水解结合与末端非还原性的糖苷键，释放出葡萄糖体和配基等，通过这些特定的酶法修饰，以期得到更高生物活性的积雪草皂苷。“佐剂”来源于拉丁文单词，意思为帮助，通过机体识别抗原、清除抗原的过程而发挥效果。免疫佐剂最早被ramon描述为一种物质能利用特殊的抗原产生的免疫性，超过单独的抗原。它是指先于抗原或与抗原合用，能非特异性增强特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质。到目前为止，用于人用疫苗的佐剂只有铝胶和MF59。铝盐佐剂(主要是氢氧化铝或其磷酸盐)一直以来都是人用疫苗中主要使用的佐剂。然而，铝盐只诱导较弱的Thl型细胞免疫应答并 诱导机体产生IgE抗体，即主要引导机体产生Th2型细胞免疫应答。而Th2型免疫应答并不能对一些主要的传染性疾病抗原如结核病、丙肝HCV或HIV抗原产生保护能力。因此，铝盐佐剂虽然相对安全，但并不适用于新型疫苗的设计使用。皂苷的免疫佐剂活性最早在20世纪20年代发现，此后国内外学者就天然植物中皂苷的免疫佐剂作用进行了大量的研究，但主要集中于南美皂树皂皮中的Quil A。但由于它们较高的毒性，不令人满意的溶血性，在水溶液中的不稳定等，都限制了它们用在人体接种疫苗时的佐剂作用。因此，开始筛选各种类型的皂苷或修饰其为具有佐剂活性的新型衍生物显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种结构新颖、药用价值大、溶血率低、安全性高且可提高机体免疫力等特点的一种免疫佐剂活性增强的大豆皂苷单体Ab亲脂性苯乙胺衍生物的制备方法。本专利技术通过碳二亚胺法合成得到反应产物，取乙酸乙酯层经分析型HPLC检测，ES1-MS鉴定目标产物分子量后，由液相制备型HPLC分离纯化得到目标产物，紫外检测器和FTIR对其做出有效地检测和判断。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现:，采用以下步骤:(I)以高纯度大豆皂苷Ab为原料，溶于吡啶，先后加入碳二亚胺试剂和苯乙胺，加水终止反应过夜后，经加乙酸乙酯振荡器间歇振摇，转至分液漏斗静置过夜，得到反应混合物；(2)取乙酸乙酯层，检测目标产物及目标产物分子量；(3)采用制备 型液相色谱分离得到苯乙胺修饰的亲脂性衍生物AbD。步骤⑴具体采用以下步骤:a、混合反应:称取大豆皂苷Ab，溶于吡啶，先后加入二环己基碳二亚胺，N-羟琥珀酰亚胺和苯乙胺，大豆皂苷、二环己基碳二亚胺、N-羟琥珀酰亚胺的质量比为80: 65-70: 35-40，吡啶与苯乙胺的体积比为500: 5_6，磁力搅拌转速为800r/min，室温下反应3天；b、加水终止反应:向反应混合液中加入超纯水，超纯水与吡啶的体积比为1: 1，控制磁力搅拌转速为800r/min,室温过夜；C、静止分层:过夜处理后加入乙酸乙酯，乙酸乙酯与超纯水的体积比为2: 1，振荡器间歇振摇lOmin，转至分液漏斗静置过夜，得到水层和乙酸乙酯层。(根据实验数据修改为比例关系，这样能够扩大专利的保护范围)所述的高纯度大豆皂苷Ab的质量分数大于99%步骤⑵采用液相色谱(HPLC)、紫外可见光二极管阵列(PDA)检测器和蒸发光散射检测器(ELSD)检测目标产物；采用电喷雾电离质谱(ES1-MS)鉴定目标产物的分子量。检测目标产物时，检测目标产物的色谱条件:分离柱=AquasilC18 (150mmX4.6mm, 3 μ m);温度:25°C;流速 lmL/min ;流动相 A:0.002% (v/v)乙酸-水溶液，B:0.002% (v/v)乙酸-乙腈溶液；检测器=PDA检测器(监控波长205nm)和ELSD检测器；HPLC梯度洗脱。HPLC梯度洗脱程序如下:本文档来自技高网...

【技术保护点】
免疫佐剂大豆皂苷Ab亲脂性苯乙胺衍生物的制备方法，其特征在于，该方法采用以下步骤：(1)以高纯度大豆皂苷Ab为原料，溶于吡啶，先后加入碳二亚胺试剂和苯乙胺，加水终止反应过夜后，经加乙酸乙酯振荡器间歇振摇，转至分液漏斗静置过夜，得到反应混合物；(2)取乙酸乙酯层，检测目标产物及目标产物分子量；(3)采用制备型液相色谱分离得到苯乙胺修饰的亲脂性衍生物AbD。

【技术特征摘要】
1.免疫佐剂大豆皂苷Ab亲脂性苯乙胺衍生物的制备方法，其特征在于，该方法采用以下步骤: (1)以高纯度大豆皂苷Ab为原料，溶于吡啶，先后加入碳二亚胺试剂和苯乙胺，加水终止反应过夜后，经加乙酸乙酯振荡器间歇振摇，转至分液漏斗静置过夜，得到反应混合物； (2)取乙酸乙酯层，检测目标产物及目标产物分子量； (3)采用制备型液相色谱分离得到苯乙胺修饰的亲脂性衍生物AbD。2.根据权利要求1所述的免疫佐剂大豆皂苷Ab亲脂性苯乙胺衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体采用以下步骤: a、混合反应:称取大豆皂苷Ab，溶于吡啶，先后加入二环己基碳二亚胺，N-羟琥珀酰亚胺和苯乙胺，大豆皂苷、二环己基碳二亚胺、N-羟琥珀酰亚胺的质量比为80: 65-70: 35-40，吡啶与苯乙胺的体积比为500: 5_6，磁力搅拌转速为800r/min，室温下反应3天； b、加水终止反应:向反应混合液中加入超纯水，超纯水与吡啶的体积比为1: 1，控制磁力搅拌转速为800r/min，室温过夜； C、静止分层:过夜处理后加入乙酸乙酯，乙酸乙酯与超纯水的体积比为2: 1，振荡器间歇振摇lOmin，转至分液漏斗静置过夜，得到水层和乙酸乙酯层。3.根据权利要求1或2所述的免疫佐剂大豆皂苷Ab亲脂性苯乙胺衍生物的制备方法，其特征在于，所述的高纯度大豆皂苷Ab的质量分数大于99%。4.根据权利要求1所述的免疫佐剂大豆皂苷Ab亲脂性苯乙胺衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(2)采用液相色谱(HPLC)、紫外可见光二极管阵列(PDA)检测器和蒸发光散射检测器(ELSD)检测目标产物；采用电喷雾电离质谱(ES1-MS)鉴定目标产物的分子量。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵大云，冯凡，任小云，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31