H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒及其引物对制造技术

本发明专利技术公开了一种H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有一对特异性引物。实验证明，应用本发明专利技术可检测H3亚型禽流感病毒，具有操作快速简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点。本发明专利技术用于H3亚型禽流感病毒导致的禽类感染，可以节约时间的成本。

【技术实现步骤摘要】
H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒及其引物对
本专利技术属于生物
，尤其涉及H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒及其引物对。
技术介绍
禽流感(avianinfluenzavirus,AI)是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的家禽及野生禽类感染及疾病的总称。其感染范围很广，几乎所有的野生及家养禽类均可感染，其中以家禽中的火鸡和鸡最为易感，发病率与死亡率较高。根据禽流感病毒(AIV)致病性强弱，将其分为高致病和低致病性AIV。以H5N1、H7N7亚型毒株为代表的高致病性AIV不仅可引起禽类的大面积死亡，甚至可以感染并致人死亡。低致病性AIV在禽类体内只表现轻微症状或不发病，未能引起人们的广泛关注。直至1999年的香港H9N2亚型AIV感染人的事件才引起世界对低致病AIV的关注。越来越多的研究报道表明低致病性AIV可以为高致病性AIV提供基因片段造成对人类的感染。H3亚型AIV虽属于低致病性AIV，但其在低致病性AIV中占有较重要地位，YiPENG等通过对2009-2011年广西地区低致病性AIVs进行病原学检测与分析，表明H3亚型AIV在家禽中分离率较高。此外，研究报道H3亚型AIV在不同家禽中分布的季节性与我国人群中流感病毒流行的季节性比较一致且有逐年上升趋势，这就为两种宿主的流感病毒在猪这个“混合器”中发生基因重排提供了条件。1968年爆发的香港流感病毒A/HongKong/68(H3N2)经研究证实是由人的H2N2亚型流感病毒与H3亚型AIV的HA基因重排得来，其PB1基因也来自于AIV。因此，加强对H3亚型AIV的监测对养禽业和公共卫生都具有重要意义。二温式PCR即二温式聚合酶链式反应，是根据常规三温式PCR技术原理改进而成的一种PCR特殊形式。二温式RT-PCR将退火和延伸合并为同一个温度，只有两种温度变化，即变性和退火-延伸温度。与常规RT-PCR相比，二温式PCR扩增程序简单，耗时短，同时由于较常规PCR退火温度高而延伸温度低，不但增强了扩增产物的特异性，也使引物的延伸变得更容易。因此，二温式RT-PCR是一种操作简单、检测速度更快更特异的技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供敏感性好、特异性强和重复性好的H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒及其引物对，以简便快速地检测H3亚型禽流感病毒。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对，包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。引物1和引物2的摩尔比为0.5-1∶0.5-1。引物1和引物2的摩尔比为1∶1。上述H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对在PCR扩增方面的应用，PCR扩增的退火温度为60.0℃-68.0℃。PCR扩增的退火温度为65℃。H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒，包括引物对、PCR缓冲液和水；引物对包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列，其浓度均为25μmol/L，在PCR反应体系中的终浓度分别为0.1μmol/L-0.5μmol/L；PCR缓冲液为2×TaqPCRMix。引物1和2在PCR反应体系中的终浓度分别为0.5μmol/L。上述H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒在PCR扩增方面的应用，PCR扩增的退火温度为60.0℃-68.0℃。PCR扩增的退火温度为65℃。针对目前缺乏对H3亚型禽流感病毒进行快速检测和诊断的有效可靠的技术，专利技术人研究设计了一对特异性引物，据此建立了H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本专利技术可检测H3亚型禽流感病毒，具有操作快速简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点。本专利技术用于H3亚型禽流感病毒导致的禽类感染，可以节约时间的成本。附图说明图1是二温式RT-PCR特异性试验结果的电泳图，图中：M.100bpDNAladder；1-5.5株H3分离株；6.H1；7.H4；8.H5；9.H6；10.H7；11.H9；12.新城疫病毒；13.传染性支气管炎病毒；14传染性喉气管炎；15.鸡毒霉形体；16.禽呼肠孤病毒；17.阴性对照。图2是二温式PCR的敏感性试验结果的电泳图，图中：M.100bpDNAladder；1-6.1×107-1×102拷贝/μL；7.阴性对照。具体实施方式以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：H1亚型禽流感病毒记载在“利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、N2亚型的分型”，病毒学报，2013，29(2):154-159，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；H3亚型禽流感病毒记载在“VisualdetectionofH3subtypeavianinfluenzavirusesbyreversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationassay”VirologyJournal,2011,5；8:337，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；H4亚型禽流感病毒记载在“H4亚型家养水禽流感病毒分离株的表面膜蛋白基因的序列测定和遗传进化分析”，畜牧兽医学报，2006,37(12),1334-1339，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；H5亚型禽流感病毒记载在“H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立”，南方农业学报，2013,02:323-327，H5亚型AIVRNA为美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室惠赠；H6亚型禽流感病毒记载在“H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立”，畜牧与兽医，2012,44(11),12-16，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；H7亚型禽流感病毒记载在“H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立”，中国兽医科技，2005,35(6),437-440，H7亚型AIVRNA为美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室惠赠；H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；新城疫病毒记载在“禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立”，生物技术通讯，2008,19(3)410-413，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；传染性支气管炎病毒记载在“应用多重反转录_聚合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的研究”，中国预防兽医学报，2000,22(2),126-130，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；传染性喉气管炎病毒记载在“传染性喉气管炎病毒疫苗的研究进展”，中国畜牧兽医，2006,33(2),41-44，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得鸡毒霉形体记载在“用SDS-PAGE分析鸡毒霉形体广西分离株的结构蛋白”，中国兽医科技，2003,33(2),41-43，公众可从广西壮族自治区本文档来自技高网...

【技术保护点】
H3亚型禽流感病毒二温式RT‑PCR检测引物对，其特征在于包括引物1和2，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对，其特征在于包括引物1和2，它们分别是序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列，所述引物1和引物2的摩尔比为0.5-1∶0.5-1。2.根据权利要求1所述的H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对，其特征在于：所述引物1和引物2的摩尔比为1∶1。3.权利要求2所述H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测引物对在PCR扩增方面的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为60.0℃-68.0℃。4.权利要求3所述的非诊断应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为65℃。5.一种H3亚型禽流感病毒二温式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括引物对、PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，刘婷婷，罗思思，谢丽基，李孟，谢志勤，邓显文，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45