本发明专利技术公开了一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法。方法步骤为：1）猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和96孔聚苯乙烯反应板包被；2）利用悬挂棉绳法，采集唾液，处理后获得唾液一抗；3）将唾液一抗，按编号加入抗原包被的反应板上，22-28℃饱和湿度反应1小时，洗涤；4）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，按顺序加入到反应板上，22-28℃饱和湿度避光反应30分钟，洗涤；5）将TMB显色剂A液和B液1:1混合后，按顺序加入到反应板上，避光反应15分钟，加入终止液；6）放入酶标仪中，读取OD650数据，判定结果。本发明专利技术避免了单个动物采血的问题，适用于猪群大面积的猪瘟抗体调查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种。
技术介绍
猪瘟(Classical swine fever, CSF)是目前危害我国养猪业最重要的疾病，其病理特征表现为小血管壁的变性，致使内脏器官多发性出血、梗塞和坏死，以出血和发热为主要特征，呈急性或慢性经过，对养猪业危害极大。猪痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)是引起猪痕的病原,该病具有高度接触性和致死性、传播速度快、流行广泛、发病率和死亡率高等特点。临床上，该病可分为急性、亚急性、慢性、非典型性和不明显型。急性CSF由强毒株引发，一般导致高发病率和死亡率，而弱毒病毒感染则表现不明显。猪瘟的发现已有180多年历史，世界各国均对该病的防控做出了巨大的努力，目前北美、澳洲和北欧的一些地区已成功地消灭了猪瘟，但猪瘟在其他许多地区仍广泛流行。墨西哥、巴西、南美的大部分地区猪瘟仍呈地方性流行，在加勒比地区古巴、海地和多米尼加都存在猪瘟，在东南亚地区的大多数国家仍存在猪瘟的间歇发生。自从1969年在我国使用兔化弱毒疫苗后，猪瘟的暴专利技术显减少。目前在我国大陆和台湾地区仍有有猪瘟流行，其中大陆多以散发和慢性病例为主，但从20世纪80年代以后，临床症状不典型且病程变长的非典型性猪瘟(或慢性猪瘟)成为该病的主要发生形式，持续感染普遍存在，疫苗的预防效果明显下降，使猪瘟防制遇到了新的困难。据估计，临床健康的猪群中，大约20%-30%的动物持续带毒；我国每年由猪瘟致死的猪占总死亡数的1/3，经济损失在20亿元左右。目前，疫苗免疫依然是我国猪瘟防控的最主要手段。采集免疫后猪只血液样本，分离血清，并检测特异性的血清抗体，是目前监控猪瘟主要的手段，对猪瘟疫苗免疫效果评价、免疫程序制定、流行状态监测均具有重要意义。然而这种采样方式存在诸多限制，一方面这种采集血液、分离血清的方法费时费力，采集的样本数量不大，占猪群的比例不高,且对动物的应激非常大。固定一头体重在50公斤左右的生长猪，并从前腔静脉采集血液，通常需要2-3个人，平均花费10分钟左右。而本专利设计的唾液样本采集方法，则以同一栏的猪为单位采集(15-20头)，只需一个人，平均花费5分钟，悬挂和收集唾液采集绳，即可。相对而言，唾液采集法获得的样本可覆盖整群动物，数据基本可代表整群动物的平均免疫情况，更能反映猪群抗体的总体水平。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种。包括如下步骤:1)猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板； 2)利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗，保存备用； 3)将唾液一抗，以PBST溶液1:1稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度反应I小时，洗涤备用； 4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以PBST溶液1:2000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度避光反应30分钟，以PBST洗涤备用； 5)将TMB显色剂A液和B液1:1混合后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul,避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸,终止反应； 6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。所述的步骤I)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪瘟C株全病毒纯化灭活抗原至10000 TCID50/ml,以IOOul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以5%脱脂奶粉封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4°C备用。所述的步骤2)为:以6股、直径3mm、长Im的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后，回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液，并收集与无菌的50ml离心管中，以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，保存备用。所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阳性样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1，而且已知阳性样品的OD值≥0.35 ;在上述条件成立的情况下，如果待检唾液样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1，而且待检唾液样品的OD值≥0.35，则判为阳性、即对应群体猪瘟抗体的阳性率> 80% ;否则判为阴性，即对应群体猪瘟抗体的阳性率< 80%。本专利技术提供的猪瘟病毒唾液抗体采集和检测方法，避免了对单个动物采血的问题，相对于传统的血清抗体采集和检测方法，具有以下优点:1)唾液抗体的棉绳采集法对猪群没有任何应激，2)节省采样时间达80%以上，3)节省2/3的采样人员，4)唾液样品对温度、环境、污染物的抵抗力更强，运输和保存更方便，4)可以对整个猪群实行大面积采样，所得结果更客观全面，5)猪瘟病毒唾液抗体检测与血清抗体检测的符合率在94%以上。【附图说明】图1是的过程示意图； 图2是本专利技术的利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗的示意图。【具体实施方式】包括如下步骤: 1)猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板； 2)利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗，保存备用； 3)将唾液一抗，以PBST溶液1:1稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度反应I小时，洗涤备用； 4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以PBST溶液1:2000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度避光反应30分钟，以PBST洗涤备用； 5)将TMB显色剂A液和B液1:1混合后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul,避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸,终止反应； 6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。所述的步骤I)为:以pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪瘟C株全病毒纯化灭活抗原至10000 TCID50/ml,以IOOul/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，并以5%脱脂奶粉封闭，获得ELISA反应的抗原基质，置于4°C备用。所述的步骤2)为:以6股、直径3mm、长Im的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后，回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液，并收集与无菌的50ml离心管中，以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，保存备用。所述的步骤6)为:将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的0D650数值，并根据以下公式判定结果:已知阳性样品与已知阴性样品的比值P/N ≥2.1，而且已知阳性样品的OD值≥0.35 ;在上述条件成立的情况下，如果待检唾液样品与已知阴性样品的比值P/N≥2.1，而且待检唾液样品的OD值≥0.35，则判为阳本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法，其特征在于包括如下步骤：1）猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板； 2）利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗，保存备用；3）将唾液一抗，以PBST溶液1:1稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，22‑28℃饱和湿度反应1小时，洗涤备用；4）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG‑FC抗体，以 PBST溶液1:2000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，22‑28℃饱和湿度避光反应30分钟，以PBST洗涤备用；5）将TMB显色剂 A液和B液1:1混合后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul，避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸，终止反应；6）放入酶标仪中，读取OD650数据，判定结果。
【技术特征摘要】
1.一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)猪瘟全病毒抗原的制备、灭活和抗原包被96孔聚苯乙烯反应板； 2)利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗，保存备用； 3)将唾液一抗，以PBST溶液1:1稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度反应I小时，洗涤备用； 4)将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以PBST溶液1:2000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加IOOul，22-28°C饱和湿度避光反应30分钟，以PBST洗涤备用； 5)将TMB显色剂A液和B液1:1混合后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul,避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸,终止反应； 6)放入酶标仪中，读取0D650数据，判定结果。2.根据权利要求1所述的一种检测猪唾液中猪瘟病毒特异性抗体的方法，其特征在于，所述的步骤I)为:以PH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释猪瘟C株全病毒纯化灭活抗原至10000 TCID50/ml,以IOOul/孔...
【专利技术属性】
技术研发人员：李龙，章叶恩，曹洋洋，
申请(专利权)人：杭州贝尔塔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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