本发明专利技术公开了一种大黄鱼鱼骨胶原肽及其制备方法和用途，该胶原肽的氨基酸序列为Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQIDNo：1），ESI-MS检测分子量823.92Da（[M+H]+824.77Da）。大黄鱼鱼骨经剁碎、脱除非胶原蛋白、脱钙和脱脂处理后，按照酸提和NaCl盐析法制备鱼骨胶原蛋白；将制备的鱼骨胶原蛋白按照料液比1g:15~20mL加入到蒸馏水中，调pH至1.2~2.0，于35~40℃保温5~10min，按照胶原蛋白质量的1.0~1.5%加入胃蛋白酶，酶解4~6h；将酶解液温度调至40~50℃，pH调至9.0~10.0，保温5~10min，按照胶原蛋白量的1.0~1.5%加入碱性蛋白酶，酶解3~5h；酶解液经高温灭酶、离心、超滤和层析，得到胶原肽。本发明专利技术制备工艺科学合理，酶解过程易于控制，制备的鱼骨胶原肽具有抗氧化活性强和安全无毒副作用的优点，可用作药品、保健食品和食品添加剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鱼类骨胶原肽及其制备方法和用途，尤其涉及一种大黄鱼鱼骨胶原肽及其制备方法和用途。
技术介绍
胶原蛋白是动物体中普遍存在的一种大分子蛋白，主要存在于动物的结缔组织（骨、软骨、皮肤、腱、韧等）中，对机体和脏器起着支持、保护、结合以及形成界隔等作用。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，比如低抗原性、促进细胞成活与生长、促进血小板凝结等，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。胶原蛋白在酸、碱、热、酶的作用下水解，会产生胶原肽，与胶原蛋白相比，由于分子量的降低和水溶性的提高，使得胶原肽更易被人体吸收与利用而发挥功效，同时，水解胶原蛋白所产生的胶原肽，也较胶原蛋白具有了更多的生物活性，如抗氧化活性、降压活性、抗肿瘤活性、提高免疫力等。 随着国内水产加工业的发展，水产加工企业产生的下脚料如鱼头、鱼皮、鱼鳞、鱼骨、鱼鳍等逐年增长。但是，水产加工下脚料的利用并不充分，造成资源浪费。因此，充分利用水产加工下脚料, 以提高综合经济效益，成为水产加工企业日益关注的问题。目前，已有资料证明水产加工下脚料鱼皮、鱼鳞、鱼骨等是提取胶原蛋白的优质原料，并已经成功利用鱼皮进行胶原蛋白或胶原肽开发。 但是，申请人研究发现，以大黄鱼鱼骨为原料，利用酶解技术制备大黄鱼鱼骨胶原蛋白和胶原肽的工艺研究处于空白阶段，而以鱼骨胶原蛋白酶解产物为材料制备抗氧化活性胶原肽及其应用更是未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种大黄鱼鱼骨胶原肽，该胶原肽安全无毒副作用，并具有较强的抗氧化作用。 本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种大黄鱼鱼骨胶原肽的制备方法，该工艺科学合理、易于操作。 本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供一种大黄鱼鱼骨胶原肽的应用。 本专利技术为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼骨胶原肽，其特征在于该胶原肽的氨基酸序列为Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1），ESI-MS检测给出分子量为m/z 823.92 Da（[M+H]+ 824.77 Da）。 本专利技术为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1）大黄鱼鱼骨剁碎后，按照料液比1 g:15~25 mL加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡3~5 h，脱除非胶原蛋白；处理后鱼骨用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后按照料液比1 g: 5~10 mL加入0.5mol/L EDTA溶液（pH7.4），于4℃下浸泡3~5天，每天更换1次EDTA溶液，脱除鱼骨中的钙；脱钙鱼骨沥干后按照料液比1 g:15~20 mL加10%异丙醇溶液，于4℃下浸泡18~24 h，去除脂肪，干燥，得脱脂鱼骨。 2）将脱脂鱼骨按照料液比1 g:10~15 mL加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡3~4天。于4℃、20000 r/min离心25~30 min，得上清液即为粗胶原蛋白；取适量粗胶原蛋白加入NaCl至溶液终浓度为0.8~1.0 mol/L，静置3~4 h至析出絮状沉淀，于4 ℃、12000 r/min离心15~20 min得沉淀物，冷冻干燥，即为盐析后的胶原蛋白。 3）将制备的胶原蛋白按照料液比1 g:15~20 mL加入到蒸馏水中，调pH至1.2~2.0，于35~40 ℃保温5~10 min，按照胶原蛋白质量的1.0~1.5%加入第一种蛋白酶，酶解4~6 h；将酶解液温度调至40~50 ℃，pH调至9.0~10.0，保温5~10 min，按照胶原蛋白量的1.0~1.5%加入第二种蛋白酶，酶解3~5 h； 4）将酶解液加热到90~95℃灭活10~15 min，9000~10000 r/min离心10~15 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽。 作为优选，所述步骤3）中的第一种蛋白酶为胃蛋白酶，酶活力≥1.5×105 U/g。 作为优选，所述步骤3）中的第二种蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.9×105 U/g。 作为改进，所述步骤4）的超滤和层析的具体过程为： 超滤：将上清液调至pH 6.5~7.5，于0.12~0.15 MPa的工作压力和25~30 ℃的工作温度下采用先后5 kDa和1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量大于5 kDa组分，分子量小于5 kDa而大于1 kDa组分，分子量小于1 kDa组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为超滤酶解液； 层析：将上述超滤酶解液用NaH2PO4-Na2HPO4（0.2mol/L，pH 7.0）缓冲液配成20~25 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂柱层析分离，用双蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成10~15 mg/mL的溶液，经凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~50 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据DPPH自由基清除率得1个高活性抗氧化肽Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）。 优选，所述阴离子交换树脂为SP-sephadex C25，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25。 再优选，所述反相高效液相色谱条件为：进样量10~15 μL；色谱柱为Kromasil C18；柱温为25~30 ℃；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈；梯度洗脱：0~40 min乙腈浓度从0至50%；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。 本专利技术为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼骨胶原肽的应用，其特征在于大黄鱼鱼骨胶原肽Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1）具有抗氧化活性强和安全无毒副作用等优点，可用作药品、保健食品和食品添加剂。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术选用胃蛋白酶和碱性蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大黄鱼鱼骨胶原肽，其特征在于该胶原肽的氨基酸序列为Gly‑Phe‑Pro‑Gly‑Ser‑Phe‑Arg（SEQ ID No：1），分子量为m/z 823.92 Da。
【技术特征摘要】
1.一种大黄鱼鱼骨胶原肽，其特征在于该胶原肽的氨基酸序列为Gly-Phe-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg（SEQ ID No：1），分子量为m/z 823.92 Da。
2.一种权利要求1所述的大黄鱼鱼骨胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）大黄鱼鱼骨剁碎后，按照料液比1 g:15~25 mL加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡3~5 h，脱除非胶原蛋白；处理后鱼骨用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后按照料液比1 g:5~10 mL加入0.5mol/L EDTA溶液（pH7.4），于4℃下浸泡3~5天，每天更换1次EDTA溶液，脱除鱼骨中的钙；脱钙鱼骨沥干后按照料液比1 g:15~20 mL加10%异丙醇溶液，于4℃下浸泡18~24 h，以去除脂肪，干燥，得脱脂鱼骨；
2）将脱脂鱼骨按照料液比1 g:10~15 mL加入0.5mol/L乙酸溶液并在4℃下浸泡3~4天；
于4℃、20000 r/min离心25~30 min，得上清液即为粗胶原蛋白；取适量粗胶原蛋白加入NaCl至溶液终浓度为0.8~1.0 mol/L，静置3~4 h至析出絮状沉淀，于4 ℃、12000 r/min离心15~20 min得沉淀物，冷冻干燥，即为盐析后的胶原蛋白；
3）将制备的胶原蛋白按照料液比1 g:15~20 mL加入到蒸馏水中，调pH至1.2~2.0，于35~40 ℃保温5~10 min，按照胶原蛋白质量的1.0~1.5%加入第一种蛋白酶，酶解4~6 h；将酶解液温度调至40~50 ℃，pH调至9.0~10.0，保温5~10 min，按照胶原蛋白量的1.0~1.5%加入第二种蛋白酶，酶解3~5 h；
4）将酶解液加热到90~95℃灭活10~15 min，9000~10000 r/min离心10~15 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）中的第一种蛋白酶为胃蛋白酶，酶活力≥1.5×105 U/g。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）中的第二种蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.5×105 U/g。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：迟长凤，王斌，陈荫，胡发远，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。