一种大黄鱼鱼鳔抗氧化胶原肽及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种大黄鱼鱼鳔胶原肽及其制备方法和用途，该胶原肽的氨基酸序列为Phe-Arg-Gly-Thr-Ile-Gly-Leu（SEQIDNo：1），ESI-MS检测给出分子量为649.72Da（[M+H]+650.53Da）。制备时自来水洗净大黄鱼鱼鳔，用高速组织捣碎机匀浆，按照料液比1g:10~15mL加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，调节pH值至6.5~7.5，于40~50℃保温10~15min;按照鱼鳔湿重的10~1.5%加入中性蛋白酶，于40~50℃温度下酶解2~4h；将上述酶解液调pH值至7.5~8.0，按照鱼鳔湿重的0.8~1.0%加入胰蛋白酶，于40~50℃温度下酶解2~4h；将酶解液加热到90~95℃灭活10~15min，4500~5000r/min离心15~20min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽。本发明专利技术制备工艺科学合理，酶解过程易于控制，制备的胶原肽具有抗氧化活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作药品、保健食品和食品添加剂。

【技术实现步骤摘要】
一种大黄鱼鱼鳔抗氧化胶原肽及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种鱼类活性抗氧化胶原肽及其制备方法和用途，尤其涉及一种大黄鱼鱼鳔抗氧化胶原肽及其制备方法和用途。
技术介绍
鱼鳔，俗名鱼泡，主要成分为胶原蛋白、黏多糖，并含有多种维生素及钙、锌、铁、硒等微量元素。鱼鳔含有的胶原蛋白，易于人体吸收和利用，可以较好改善人体组织营养状况和加速新陈代谢，是人体补充、合成蛋白质的优质原料。但是，申请人研究发现，以大黄鱼鱼鳔为原料，利用酶解技术制备大黄鱼鱼鳔胶原肽的工艺研究处于空白阶段，而以鱼鳔酶解产物为材料制备抗氧化活性胶原肽及其应用更是未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种大黄鱼鱼鳔胶原肽，该胶原肽安全无毒副作用，易于消化吸收，具有较强的抗氧化作用。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种大黄鱼鱼鳔胶原肽的制备方法，该工艺科学合理、易于操作。本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供一种大黄鱼鱼鳔胶原肽的应用。本专利技术为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼鳔胶原肽，其特征在于该胶原肽的氨基酸序列为Phe-Arg-Gly-Thr-Ile-Gly-Leu（SEQIDNo：1），ESI-MS检测给出分子量为m/z649.72Da（[M+H]+650.53Da）。本专利技术为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼鳔胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）将大黄鱼鱼鳔用自来水洗净，用高速组织捣碎机匀浆，按照料液比1g:10~15mL加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，调节pH值至6.5~7.5，于40~50℃保温10~15min;按照鱼鳔湿重的1.0~1.5%加入第一种蛋白酶，于40~50℃温度下酶解2~4h;2）将上述酶解液调pH值至7.5~8.0，按照鱼鳔湿重的0.8~1.0%加入第二种蛋白酶，于40~50℃温度下酶解2~4h;3）将酶解液加热到90~95℃灭活10~15min，4500~5000r/min离心15~20min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽。作为优选，所述步骤1）中的第一种蛋白酶为中性蛋白酶，酶活力≥5.0×105U/g。作为优选，所述步骤2）中的第二种蛋白酶为胰蛋白酶，酶活力≥1.85×106U/g。作为改进，所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：超滤：将上清液调至pH6.5~7.5，于0.10~0.15MPa的工作压力和25~30℃的工作温度下采用3kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa组分，得超滤酶解液；层析：将上述超滤酶解液用双蒸水配成20~25mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.45~0.55mol/L和0.90~1.10mol/LNaCl溶液进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，超氧阴离子自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成10~15mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，超氧阴离子自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~50μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据超氧阴离子自由基清除率得1个高活性抗氧化肽Phe-Arg-Gly-Thr-Ile-Gly-Leu（SEQIDNo：1）。优选，所述阴离子交换树脂为DEAE-52cellulose，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25。再优选，所述反相高效液相色谱条件为：进样量10~15μL；色谱柱为KromasilC18；柱温为25~30℃；流动相：30%乙腈；洗脱速度1.0mL/min；紫外检测波长280nm。本专利技术为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种大黄鱼鱼鳔胶原肽的应用，其特征在于大黄鱼鱼鳔胶原肽Phe-Arg-Gly-Thr-Ile-Gly-Leu（SEQIDNo：1）对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Phe-Arg-Gly-Thr-Ile-Gly-Leu（SEQIDNo：1）亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Phe-Arg-Gly-Thr-Ile-Gly-Leu（SEQIDNo：1）具有抗氧化活性强、易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作药品、保健食品和食品添加剂。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术选用中性蛋白酶和胰蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，酶解过程易监控，使抗氧化胶原肽最大程度地释放出来；制备的抗氧化胶原肽是鱼鳔胶原蛋白经酶水解制得，安全、无毒副作用，并且抗氧化作用显著，可用作药品、保健食品和食品添加剂。附图说明图1是本专利技术的阴离子交换树脂DEAE-52cellulose层析图图2是本专利技术的阴离子交换树脂DEAE-52cellulose层析所分离各组分的超氧阴离子自由基清除活性图；图3是本专利技术的葡聚糖凝胶G-25层析图；图4是本专利技术的葡聚糖凝胶G-25层析所分离各组分的超氧阴离子自由基清除活性图；图5是本专利技术的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物（F32）的RP-HPLC图；图6是本专利技术的抗氧化胶原肽Phe-Arg-Gly-Thr-Ile-Gly-Leu（SEQIDNo：1）的RP-HPLC图；图7是本专利技术的Phe-Arg-Gly-Thr-Ile-Gly-Leu（SEQIDNo：1）的质谱（ESI-MS）图和结构式。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。一种大黄鱼鱼鳔胶原肽的制备方法，制备工艺流程如下：大黄鱼鱼鳔"组织捣碎"双酶酶解"酶解物"超滤"离子交换层析"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"胶原肽。实施例1：1）将大黄鱼鱼鳔用自来水洗净，用高速组织捣碎机匀浆，按照料液比1g:15mL加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，调节pH值至7.0，于45℃保温10min;按照鱼鳔湿重的1.5%加入中性蛋白酶（酶活力≥5.0×105U/g），于45℃温度下酶解3h;2）将上述酶解液调pH值至8.0，按照鱼鳔湿重的1.0%加入胰蛋白酶（酶活力≥1.85×106U/g），于45℃温度下酶解3h;3）将酶解液加热到90℃灭活15min，5000r/min离心15min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽。①超滤：将酶解上清液调至pH7.0，于0.15MPa的工作压力和30℃的工作温度下采用3kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液；②DEAE-52cellulose阴离子交换层析：将上述超滤酶解液用双蒸水配成25mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.50mol/L和1.0mol/LNaCl溶液进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，超氧阴离子自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液（F3）（图1）③凝胶层析：将上述离子交换层析酶解液（F3）用双蒸水配成15mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，超氧阴离子自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物（F32）（图2）④高效液相色谱精制：将上述凝胶制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大黄鱼鱼鳔蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Phe‑Arg‑Gly‑Thr‑Ile‑Gly‑Leu（SEQ ID No：1），分子量为649.72 Da。

【技术特征摘要】
1.一种大黄鱼鱼鳔胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）将大黄鱼鱼鳔用自来水洗净，用高速组织捣碎机匀浆，按照料液比1g:10~15mL加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，调节pH值至6.5~7.5，于40~50℃保温10~15min;按照鱼鳔湿重的1.0~1.5%加入第一种蛋白酶，于40~50℃温度下酶解2~4h;2）将上述酶解液调pH值至7.5~8.0，按照鱼鳔湿重的0.8~1.0%加入第二种蛋白酶，于40~50℃温度下酶解2~4h;3）将酶解液加热到90~95℃灭活10~15min，4500~5000r/min离心15~20min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到胶原肽所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：超滤：将上清液调至pH6.5~7.5，于0.10~0.15MPa的工作压力和25~30℃的工作温度下采用3kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液；层析：将上述超滤酶解液用双蒸水配成20~25mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.45~0.55mol/L和0.90~1.10mol/LNaCl溶液进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，超氧阴离子自由基清除活性最高组分为离子交换...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟长凤，王斌，陈荫，胡发远，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33