本发明专利技术公开了一种杂交瘤细胞株及其产生的抗犬瘟热病病毒N蛋白的单克隆抗体CDV-1N8，属于CDV的防治领域。本发明专利技术筛选得到一株稳定分泌抗CDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC No.8793，实验证明，该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体CDV-1N8与CDV的N蛋白能够发生特异性反应，而与Vero细胞蛋白不发生反应。本发明专利技术公开的单克隆抗体能特异的识别CDV-N蛋白，且其识别的CDV-N蛋白的B细胞表位精确定位为：QITFLHSERS。本发明专利技术的单克隆抗体CDV-1N8以及该单克隆抗体所识别的CDV N蛋白病毒特异性保守B细胞表位多肽可制备成诊断CDV感染的试剂，为建立CDV的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
一种杂交瘤细胞株及其产生的抗犬瘟热病病毒N蛋白的单克隆抗体
本专利技术属于微生物相关的基因工程领域，具体涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的抗犬瘟热病病毒N蛋白的单克隆抗体。
技术介绍
犬瘟热(Canine distemper,⑶)⑶是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus,⑶V)引起的急性、热性、高度接触性传染病。⑶V的自然感染宿主包括传统的犬科、鼬科和浣熊科，但目前已经扩展到了食肉目的所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属及鳍足目海豹科等多种动物，其发病率高几乎可达100%，由于该病临床症状多样，易继发其他细菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率甚至可高达80%，有着“毁灭性传染病”之称，对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成严重的经济损失。另外近期研究表明，CDV在体外能够感染人的前体破骨细胞，犬瘟热可能是犬传染给人的第二种病毒性传染病。CD是于1809年由Jeneer首次报道，1905年Carre首次发现CDV，所以本病也曾称为Carre氏病。银黑狐CD是于1925年首先由Green在美国养狐场发现，1928年Rudolf同时发现了水貂、银黑狐和貉⑶，C.E.苏列纳于1953年确诊了紫貂⑶，1957年B.A.潘柯夫报道了北极狐CD，我国是从1972年起相继在水貂、狐、貉等毛皮动物中发生犬瘟热，特别是大熊猫等国宝动物的CDV感染，使得CDV的致病地位日益突出。CD感染的动物范围及分布范围还有着不断扩大 的趋势。王贵升等(2013)年对山东地区40家养殖规模在3000只以上的养殖场的155份毛皮动物病例进行了 RT-PCR法检测，结果表明送检病例中犬瘟热的检出率为63.87%。这表明CD对我国的毛皮动物养殖业具有相当大的威胁。犬瘟热呈世界性分布，且在不同物种间存在交叉感染，犬瘟热不可能被完全消灭，目前尚无针对犬瘟热的特效治疗药物和方法，疫苗接种是一种有效的防制措施，但常规疫苗在不同程度上存在着弊端:犬瘟热病毒灭活苗抗原性差，现已很少使用；麻疹病毒异源苗免疫力持续时间短；弱毒疫苗对热不稳定且对某些免疫缺陷的幼犬和野生食肉动物存在不安全性及发生变态反应得危险。因此必须加强对CD的研究，为进一步研究安全性高、免疫力持久疫苗提供技术支持。CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属，与麻疹病毒亲缘关系最近。CDV为不分节片的单股负链RNA病毒，由15616个核苷酸组成，分子量为6X 106Da。⑶V的基因组编码6种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(N)、憐蛋白(P)、大蛋白(L)、|]旲蛋白(Μ)、血凝素蛋白(H)、融合蛋白(F)。N蛋白是核衣壳主要组成成分，据Hamburger等报道，CDV的毒力与N蛋白密切相关，CDV的毒力在中枢神经系统的持续性感染中具有重要作用。N蛋白是保守性较强的免疫原性蛋白，除了含有B细胞表位外，也含有T细胞表位，在犬瘟热病毒感染的早期免疫应答中起着主要作用，能引起强烈的抗体反应。因此，N蛋白在犬瘟热的早期诊断及防治上有重要的作用。所以，筛选出一株可以分泌抗CDV-N蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定出其所分泌的单克隆抗体所识别的CDV-N蛋白特异性B细胞表位多肽对CDV的诊断及预防具有积极意义，并为CDV亚单位疫苗的研制奠定基础。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一株分泌⑶V-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本专利技术目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与CDV-N蛋白发生特异性反应；本专利技术上述目的是通过以下技术方案来实现的:本专利技术采用TRIZOL法提取⑶V病毒总RNA，反转录克隆N蛋白基因的cDNA，将该cDNA插入原核表达载体pEASY-El，利用pEASY_El原核表达载体对CDV-N基因进行原核表达，将所表达出的包涵体形式的⑶V-N蛋白经HIS标签亲和纯化后作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。此外，本专利技术还利用大肠杆菌表达系统对CDV-N基因进行原核表达，对所表达的包涵体形式的CDV-N蛋白进行包涵体纯化后作为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选，最终获得一株稳定分泌抗CDV-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是=CGMCC N0.8793，其分泌的抗体命名为CDV-1N8，分类命名是:分泌犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞；保藏时间:2014年3月3日；保藏单位是:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是:北京市朝阳区北辰西 路I号院3号中国科学院微生物研究所。本专利技术还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，其命名为CDV-1N8，ffestern-blot检测结果表明单克隆抗体CDV-1N8可与CDV-N蛋白发生特异性反应，而与对照Vero细胞蛋白不发生反应；IFA检测结果表明单克隆抗体CDV-1N8与CDV发生特异性反应。[0011 ] 本专利技术利用噬菌体多肽库技术对⑶V-1N8所识别的⑶V-N蛋白的B细胞表位进行了鉴定，最终将表位精确定位为:QITFLHSERS。同时，序列比对结果显示这个表位多肽为CDV所特有并保守的B细胞表位多肽。因此，本专利技术提出了所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或预防犬瘟热病毒感染药物中的应用。及所述的单克隆抗体在制备诊断或预防犬瘟热病毒感染药物中的应用。及所述的CDV-N蛋白线性B细胞表位多肽在制备诊断犬瘟热病毒感染药物中的应用。综上所述，本专利技术制备并鉴定出了一种特异性针对CDV-N蛋白的单克隆抗体，本专利技术的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的CDV-N蛋白病毒特异性保守B细胞表位多肽可用于制备成诊断或预防CDV病毒感染的试剂。【附图说明】图1是重组pEASY-El-Ν蛋白的SDS-PAGE分析结果(M:标准蛋白Marker ； I:pEASY-El-N诱导前产物；2:pEASY-El_N诱导后产物；3:pEASY-El_N纯化产物)。图2是单克隆抗体⑶V-1N8亚类鉴定。图3是为应用Western blot试验检测单克隆抗体CDV1N8与CDV蛋白和Vero细胞的反应性结果WB分析(1:⑶V1N8与⑶V感染的细胞裂解沉淀的反应；2:⑶V-1N8与Vero细胞裂解沉淀的反应;M:标准蛋白Marker)。图4是为应用间接免疫荧光试验检测单克隆抗体CDV-1N8与CDV蛋白反应性结果分析。图5是为应用间接免疫荧光试验检测单克隆抗体CDV-1N8与CDV蛋白反应性结果分析。图6是合成短肽与⑶V-1N8反应性的间接ELISA分析(其中短肽I序列(对照):LLKIRQIRSITR,短肽2序列:QITFLHSERS，短肽3序列(对照):IKIRHNPTIQKR，短肽4序列(对照):PSRNKPIIPLTM)O【具体实施方式】下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会在逐步描述中更为显现。【具体实施方式】主要实验材料和来源1.蛋白、细胞、病毒原核表达并纯化的⑶V-N蛋白、SP2/0细胞、Vero细胞和⑶V毒株均由本实验室保存。2.主要试剂和药品胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗体、FI本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株杂交瘤细胞株，能稳定的分泌抗CDV‑N蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述杂交瘤细胞株命名为CDV‑1N8，微生物保藏号为：CGMCC No.8793。
【技术特征摘要】
1.一株杂交瘤细胞株，能稳定的分泌抗CDV-N蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述杂交瘤细胞株命名为⑶V-1N8，微生物保藏号为=CGMCC N0.8793。2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体命名为CDV-1N8。4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克...
【专利技术属性】
技术研发人员：程世鹏，易立，陈立志，程悦宁，王建科，仝明薇，
申请(专利权)人：吉林特研生物技术有限责任公司，中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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