一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用。本发明专利技术所述单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CGMCC NO.9153。本发明专利技术以经过优化的PDI家族成员蛋白为抗原蛋白，制备了单克隆抗体杂交瘤细胞及其分泌产生的单克隆抗体，该杂交瘤细胞能够稳定产生抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体具有双向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反应，可应用于治疗血栓性疾病和凝血性疾病的药物制备中。

【技术实现步骤摘要】
一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用。
技术介绍
血栓是指血液成分在血液流动过程中，在血管或心脏内膜表面形成的一种半凝块状物质。血栓由不溶性纤维蛋白、沉积的血小板、积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。血栓形成是一种涉及许多彼此相互作用的遗传和环境因素的多因素变化的过程。在临床上常见到血栓性疾病，如冠脉综合征、深静脉血栓等。血栓性疾病属于心脑血管疾病，全球每年因心脑血管疾病死亡人数达1200万，相当于世界总死亡人数的1/4，已成为人类生命的头号杀手。弥散性血管内凝血(DIC)又称消耗性凝血病、去纤维蛋白综合征。DIC是一种影响中枢神经系统最为常见和严重的凝血疾病。常见病因有严重感染、创伤、产科和血管病急症、癌症、非细菌性血栓性心脑膜炎、蛛网膜下腔出血、脑肿瘤、脑血管畸形，心、肝、肾功能衰竭和免疫性疾病等。在各种致病因素的作用下，血循环内出现局限的或弥漫性的凝血促动，凝血瀑布被激活，产生过量的凝血酶。凝血系统进一步被激活，使血液凝固性增高，破坏了体内凝血和抗凝过程的平衡，易引起脑组织缺血、缺氧和缺血性梗死。针对血栓和DIC两种疾病，国内外已经研究和开发了很多药物。主要包括两大类药物，如抗凝血药物肝素、华法林、Fondaparinux、水蛭素等，以及抗血小板药物磷酸二酯酶抑制剂、阿西匹林、ADP受体抑制剂、GPIIb/IIIa受体抑制剂等。以上药物的缺陷在于它们的作用只限于单一靶点。而蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,PDI)家族成员可以调控不同底物蛋白的二硫键状态，能作用于多个靶点。但是，目前鲜有针对蛋白质二硫键异构酶(PDI)家族成员用于预防和治疗血栓性疾病和弥散性血管内凝血的研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供抗一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体，使所产生的单克隆抗体具有防治血栓形成和抑制凝血酶的作用，可以应用于治疗血栓性疾病和如弥散性血管内凝血这种凝血性疾病的药物制备中。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNO.9153。本专利技术所述单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：SEQIDNO:1所示氨基酸序列的蛋白免疫BALB/C小鼠，3天后取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞按照5∶1～10∶1的比例混合，利用PEG进行细胞融合，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆至能稳定分泌抗SEQIDNO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体，获得所述单克隆抗体杂交瘤细胞。其中，所述SEQIDNO:1所示氨基酸序列的蛋白免疫BALB/C小鼠具体为：取SEQIDNO:1所示氨基酸序列的蛋白100μg加等质量福氏完全佐剂对BALB/C小鼠进行第一次皮下注射，21天后取SEQIDNO:1所示氨基酸序列的蛋白300μg加等质量福氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行第二次皮下注射，10天后尾部采血并用ELISA间接法测定抗SEQIDNO:1所示氨基酸序列蛋白的鼠血清效价，选择效价高的BALB/C小鼠用SEQIDNO:1所示氨基酸序列的蛋白100μg进行免疫。本专利技术所用抗原蛋白选自蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,PDI)家族，通过优化编码基因表达所述抗原蛋白，以其实现所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体具有双向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反应。所述抗原蛋白可由试剂公司进行全合成，或参照SEQIDNO:2所示核苷酸序列进行常规表达获得。经过上述方法制备后，最终筛选出能够稳定分泌抗SEQIDNO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为DuIn，并于2014年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.9153。此外，本专利技术还提供一种抗SEQIDNO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体(以下简称DuIn抗体)，由保藏编号为CGMCCNO.9153的杂交瘤细胞分泌产生。制备DuIn抗体可采用本
常规方法，如用杂交瘤细胞株诱导小鼠腹水，本专利技术优选为：步骤1、用不完全佐剂免疫BALB/C小鼠1～2周后，分别往小鼠腹腔注射1×106个保藏编号为CGMCCNO.9153的杂交瘤细胞，接种所述杂交瘤细胞7～10天后产生腹水；步骤2、从所述BALB/C小鼠腹腔抽取腹水，置于15ml离心管中，2000rpm离心10min，以沉淀血细胞及其它杂质，将上清转移入新的离心管中，放入-80℃冰箱保存，纯化前，使用0.1M的PBS溶液按1:3的比例稀释腹水；取0.5mlProteinG装入吸附柱中，加入20倍柱体积的0.1M的PBS缓冲液平衡柱子，以备上样；取稀释的腹水，加入纯化柱中，每次2-3ml，腹水循环过柱3遍；步骤3、待腹水循环过柱3遍后，加上30倍柱体积的0.1M的PBS缓冲液充分洗涤柱子，洗掉杂蛋白；洗涤完毕后，加0.1M、pH值为2.8的Gly洗脱液洗脱结合的抗体，预先在收集管中加入25ul1M、pH值8.9的Tris-Hcl，每管收集500ul的洗脱液，连续收集10管；使用显色液测定每管收集液是否含有蛋白质，取蛋白含量最多的收集液进行透析，透析后获得DuIn抗体。本专利技术制备的DuIn抗体具有双向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反应。如抑制血小板聚集、抑制血小板表面整合素αIIbβ3的活化、抑制血小板表面p-selectin的表达、明显抑制血栓形成、明显抑制体内血小板积聚和纤维蛋白形成、体外明显抑制凝血酶生成。基于此，本专利技术提供所述单克隆抗体在制备治疗血栓性疾病或凝血性疾病药物中的应用。其中作为优选，所述血栓性疾病为冠脉综合征或深静脉血栓；所述凝血性疾病为弥散性血管内凝血病。由以上技术方案可知，本专利技术以经过优化的PDI家族成员蛋白为抗原蛋白，制备了单克隆抗体杂交瘤细胞及其分泌产生的单克隆抗体，该杂交瘤细胞能够稳定产生DuIn抗体，该单克隆抗体具有双向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反应，可应用于治疗血栓性疾病和凝血性疾病的药物制备中。生物保藏信息说明抗ERp57单克隆抗体杂交瘤细胞于2014年4月29日保藏在保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.9153。附图说明图1所示为DuIn抗体特异性检测的聚集曲线图，其中，曲线1为ERp57fl/fl小鼠血小板经DuIn抗体60μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线2为ERp57fl/fl小鼠血小板经DuIn抗体30μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线3为ERp57fl/fl小鼠血小板经DuIn抗体15μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线4为ERp57fl/fl小鼠血小板经IgG2a60μg/mL孵育后的聚集曲线；横坐标为时间min，对应时间为1min、2min、3min、4min，纵坐标为透光度％；图2所示为DuIn抗体特异性检测的聚集曲线图，其中，曲线1为PF4-Cre/ERp57fl/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杂交瘤细胞，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.9153。

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞，其特征在于，保藏编号为CGMCCNO.9153。2.保藏编号为CGMCCNO.9153的杂交瘤细胞在制备抗SEQIDNO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体中的应用。3.一种抗SEQIDNO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCCNO.9153的杂交瘤细胞分泌产生。4.权利要求3所述单克隆抗体在制备治疗血栓性疾病或凝血性疾病药物中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述血栓性疾病为冠脉综合征或深静脉血栓。6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述凝血性疾病为弥散性血管内凝血病。7.权利要求3所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、用不完全佐剂免疫BALB/C小鼠1～2周后，分别往小鼠腹腔注射1×106个保藏编号为CGMCCNO.9153的杂交瘤细胞，接种所述杂交瘤细胞7～10天后产生腹水；步骤2、...

【专利技术属性】
技术研发人员：武艺，周俊松，陈凤梧，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32