抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术公开了抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，解决了可靠的LM单克隆抗体不易获得的问题，经多年多次传代，能稳定分泌单克隆抗体，它分泌的单克隆抗体，应用于液相芯片和胶体金法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌，具有良好的灵敏性、特异性、稳定性和可重复性等优点。病原在浓度很低的情况下也能被检出，进一步提高检测灵敏度和检出率，严防漏检和误检。

【技术实现步骤摘要】
抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体及应用
本专利技术属于生物
，确切地说是抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体及应用。
技术介绍
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是最常见的食源性致病菌之一，WHO将其与大肠杆菌0157:H7、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌并列为20世纪90年代四大食源性致病菌。LM是李斯特菌属中致病力最强的细菌，也是唯一对人致病的、典型的胞内寄生菌，可穿越宿主三道屏障，从而导致严重的人畜共患传染病，如胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产等。孕妇、新生儿、老年人以及免疫功能缺陷者感染该菌后致死率达20-30%，新生儿等免疫力低下者的致死率高达70%。牛、马、羊、兔、鸡、猪等畜禽感染该菌后会造成严重的脑膜炎、坏死性心肌炎及坏死性肝炎，致死率为52-100%。近年来，食品感染LM而引起的召回或销毁事件也不断发生，给食品行业和国民经济造成了重大损失，已报道的2011年期间全球范围内的食品召回事件高达17起。为此在三十三届食品法典委员会会议上专门设立了《食品中产单核李斯特菌控制守则》等三个议题，许多国家将LM列为严重的食品污染菌和零检出项目。目前，我国对LM的检测主要采用传统的分离培养检测及鉴定、PCR、ELISA和全自动鉴定系统等检测技术，传统的分离培养与生化鉴定一般需要3-7天，检测周期长，操作繁琐；PCR技术需要提取核酸后进行扩增，DNA提取过程中易受到外源核酸的影响，同时食品中的杂质和杂菌均会抑制PCR扩增，造成假阴性的出现；国内市场没有专门针对LM的ELISA试剂盒，所以LM的ELISA检测均需购买国外进口试剂盒，这无疑增加了检测成本，限制了 ELISA的广泛应用；全自动鉴定系统价格高昂，很难在基层实验室普及。而且以上检测都存在一个共同的问题——在实际样品的实测中，均需要对食品进行预培养，以期通过增菌过程来提高LM的数量，但这样无疑延长了检测时间，不适合食源性致病菌的快速检测。针对这一实际情况，建立一套专门针对食品中微量LM的灵敏、准确、特异、快速的检测技术，以保证病原在浓度很低的情况下也能被检出，进一步提高检测灵敏度和检出率，严防漏检和误检，是食品中微量致病菌检测亟待解决的问题之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提高检测食品中微量LM的灵敏性、准确性、特异性问题，而提供一株抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用。抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，它的保藏编号为=CGMCCN0.6252 ； 抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体，它是由上述的抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的；一种液相芯片检测单增生李斯特氏菌的试剂盒，它的检测抗体为上述的抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体； 一种胶体金检测单增生李斯特氏菌的试纸条，它的检测抗体为上述的抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体。本专利技术提供了抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，解决了可靠的LM单克隆抗体不易获得的问题，经多年多次传代，能稳定分泌单克隆抗体，它分泌的单克隆抗体，应用于液相芯片和胶体金法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌，具有良好的灵敏性、特异性、稳定性和可重复性等优点。病原在浓度很低的情况下也能被检出，进一步提高检测灵敏度和检出率，严防漏检和误检。【附图说明】图1融合10天后倒置显微镜观察及染色体计数结果； 图2单克隆抗体柱纯化蛋白含量测定结果； 图3单克隆抗体SDS-PAGE电泳检测结果； 图4多克隆抗体的SDS-PAGE检测结果； 图5捕获抗体最佳工作浓度的确定； 图6灵敏度检测结果； 图7特异性检测结果； 图8重复性检测结果； 图9胶体金试纸条的组装顺序。【具体实施方式】实施例1单核细胞增生李斯特菌抗原菌液的制备和BALB/c小鼠免疫 取本室_80°C保存的单核细胞增生李斯特菌U7tr7W77)，划线法接种于胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA)培养基(pH7.3 土 0.1)上培养，常规方法增菌培养，6000r/min离心IOmin,收集菌体沉淀，用灭菌生理盐水重复离洗三次后进行菌落计数(2.4X IO9 CFU/mL),加入终浓度为0.3%的甲醛4°C过夜使菌体灭活。次日将洗脱好的菌液在20KHZ、150W的冰浴条件下进行超声波使菌体细胞破碎，每次破碎10s，间隔10s，总用时20min。采用BCA蛋白测定试剂盒测定菌体蛋白含量，结果为2.548 mg/mL。取8周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫。首免采用上述灭活菌液(2X 108CFU/mL)与等量弗氏完全佐剂混合后腹腔注射50 μ L，皮下注射50 μ L，以后每隔2周免疫I次，换用弗氏不完全佐剂，剂量同前，共免3次。实施例2免疫小鼠血清抗体效价的测定 3免后，小鼠断尾采血，用常规间接ELISA方法检测血清效价。其中，包被抗原是实施例1所制备的单核细胞增生李斯特菌菌液，稀释度为1:40，阳性血清稀释度1:1600，酶标二抗为HRP(辣根过氧化物酶)标记的兔抗小鼠IgG (稀释度为1:15000)。测定结果表明，抗体效价为1:12800。 实施例3单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备 (I)杂交瘤细胞株的建立①饲养细胞的制备:正常BABL/C小鼠断颈处死，将8mL HAT培养液注入腹腔，轻轻摇动小鼠身体数下后抽出培养液，调整细胞浓度至105，按每孔100 μ L加入96孔细胞培养板，置370C，5%C02细胞培养箱中培养过夜备用，此即为饲养细胞。②骨髓瘤细胞的培养与细胞悬液的制备:融合前一周复苏骨髓瘤细胞(SP2/0)，隔1天传代1次，融合选在传代后1天进行。融合前取约4瓶(25cm2) SP2/0细胞，用RPM1-1640培养液吹下各瓶细胞，1200r/min离心10min，重复2_3次，使用细胞计数板计数。③脾细胞悬液的制备:免疫小鼠摘眼球采血，4°C过夜后2500r/min离心10min，取血清于-20°C保存备用。小鼠处死后，常规方法取脾并用RPM1-1640培养液制备脾细胞悬液，计数。④细胞融合:调整上述制备SP2/0细胞与脾细胞数量比为1:5~1:10。1200r/min离心10min,弃上清液。轻弹离心瓶底,使细胞松散。在30s内逐滴缓慢加入37°C预热的PEG 0.8mL，静置60s。逐滴加入RPMI1640培养液，稀释离心瓶内PEG浓度，逐渐加快滴加速度，共加入RPMI1640培养液30mL。融合过程在8min内完成。1200r/min离心10min，弃上清液，加入40mL预热的HAT培养液，静置15min，滴到前一天制备的饲养细胞板中，每孔100 μ L0置于37°C，5%的CO2培养箱中培养。融合后3_4天，在倒置显微镜下观察融合成功的细胞团出现，计算克隆数。第3-4天，6-7天用HAT培养液进行半量换液，第9-10天起用HT培养液进行半量换液。⑤阳性杂交瘤细胞株的筛选:待融合细胞生长至1/2视野(100倍镜下)以上时，如图1所示，可以进行上清效价检测，方法为常规间接ELISA法(阴性对照用SP2/0培养上清)。结果表明，筛出阳性杂交瘤细胞三孔，分别为3-B9、4-C3、5-B3。在亚克隆过程中，3-B9、4-C3本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，它的保藏编号为：CGMCC No.6252。

【技术特征摘要】
1.抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，它的保藏编号为=CGMCCN0.6252。2.抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体，它是权利要求1所述的抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的。3.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟日增，刘韬，刘金华，赵庆松，王宁，聂丹丹，
申请(专利权)人：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：吉林;22