分泌抗柑橘碎叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。克隆了柑橘碎叶病毒(CTLV)的外壳蛋白基因，利用原核表达系统表达了该病毒的外壳蛋白，用表达纯化的蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗CTLV特异性单抗的杂交瘤细胞株6C5，其保藏号为CGMCCNo.8779。该单克隆抗体腹水间接ELISA效价均达到10-7，抗体类型及亚类均为IgG1，kappa链。利用单抗建立的检测柑橘中CTLV的dot-ELISA方法，当病叶1:640倍稀释(w/v,g/mL)时仍能检测到病毒。分泌抗CTLV单抗杂交瘤细胞及其单抗的获得和相关血清学检测方法的建立为该柑橘病毒病的诊断、预测预报及科学防控提供技术和物质支撑。

【技术实现步骤摘要】
分泌抗柑橘碎叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
技术介绍
柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus, CTLV)引起的柑橘碎叶病在我国分布广泛，台湾、浙江、广西、湖南、湖北和四川等省(区)均有分布，为我国继柑橘衰退病和裂皮病之后的一种重要的柑橘病毒病。起源于我国的柑橘品种温州蜜桔和北京柠檬被认为是该病毒的最初来源，因北京柠檬的感病接穗在厚皮莱蒙植株上，能引起叶片黄斑、变小、叶缘破碎，故称碎叶病。在我国的临近地区如韩国、日本、菲律宾CTLV的发生也极其普遍，在南非、美国和澳大利亚的北京柠檬上检测到了 CTLV。CTLV病毒为发状病毒属(JJeipillovirus)成员，是侵染柑橘的重要病原之一。CTLV病毒粒子为曲杆状，大小约为600-700 nmX 13-15nm。致死温度为60-70°C (lOmin)，稀释终点10-4-10-5，体外保毒期为4-8 d。它主要通过嫁接和受污染的工具传播，实验室发现昆诺黎、豇豆和大豆的种子可以传播CTLV，至今还未发现昆虫传播介体。碎叶病毒在柑橘类植物中有广泛的寄主，在本地早、早橘、朱红、北京柠檬、文旦柚、蕉柑、兴津早温、宫川早温、红心柚、冰糖橙、大红甜橙、雪柑、暗柳、新会橙、改良橙、森田脐橙、贡柑、砂糖柑等品种中都鉴定到CTLV。在日本发现野百合也是CTLV的寄主。人工汁液摩擦接种条件下，CTLV侵染豇豆、菜豆、黄瓜、烟草、向日葵、苋色藜、昆诺黎和克里夫兰烟。柑橘碎叶病毒在昆诺黎的接种叶片表现黄色斑点，上部未接种叶片表现出明脉或皱缩，在克里夫兰烟上表现为系统斑驳、花叶，在豇豆上表现为局部枯斑，在鸡冠花上表现为局部环斑。CTLV在多种柑橘品种上存在隐症现象，只有在一些敏感品种上才出现症状，且不同品种、不同接种条件和不同接种方式都会引起症状上存在一定差异。为了掌控柑橘发病状况，强化我国柑橘碎叶病早期监测和预警，科学指导防控，急需建立检测柑橘中CTLV的高通量的检测方法，而目前没有这种高通量的检测方法，仅用低效率的电镜观察、RT-PCR方法、核酸电泳等方法进行小样本检测。本专利技术以原核表达的CTLV衣壳蛋白(CP)为抗原通过杂交瘤技术制备了 I株抗CTLV的特异性单克隆抗体，以制备的单抗为核心建立了检测CTLV的高通量的血清学方法，并成功应用于田间CTLV的检测，从而为我国柑橘碎叶病毒病早期监测和预警，防控策略提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C5,它能分泌抗柑橘碎叶病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株6C5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8779。 抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10'抗体类型及亚类为IgGU kappa链，该单克隆抗体能与柑橘碎叶病毒27kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体仅与柑橘碎叶病毒有特异性免疫反应，而与柑橘衰退病毒、柑橘裂皮病类病毒、芜菁花叶病毒、番爺花叶病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒、香蕉线条病毒、香蕉苞片嵌纹病毒均不发生免疫反应； 抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体在柑橘碎叶病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果:1)提供的杂交瘤细胞株6C5分泌抗柑橘碎叶病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的TAS-ELISA和dot-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测柑橘碎叶病毒；2)利用本专利技术所制备的单克隆抗体检测柑橘碎叶病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本专利技术所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间柑橘类样品中的柑橘碎叶病毒的检测。【附图说明】图1是dot-ELISA方法检测柑橘CTLV的灵敏度分析； 图2是dot-ELISA方法检测柑橘田间样品中CTLV的结果； 生物保藏 杂交瘤细胞株6C5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101，保藏日期为:2014年I月22日，保藏号为CGMCC N0.8779。【具体实施方式】分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C5于2014年I月22日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8779，它能分泌抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体。抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价均达10'抗体类型及亚类均为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与柑橘碎叶病毒27kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体仅与柑橘碎叶病毒有特异性免疫反应，而与柑橘衰退病毒、柑橘裂皮病类病毒、芜菁花叶病毒、番爺花叶病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒、香蕉线条病毒、香蕉苞片嵌纹病毒均不发生免疫反应。抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。本专利技术提供的杂交瘤细胞株6C5能大量分泌抗柑橘碎叶病毒单抗，且其分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测CTLV的高通量的血清学方法及其试剂盒，可成功应用于田间CTLV的检测，从而为我国柑橘碎叶病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步说明。一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备1.免疫原及检测抗原的制备 根据已报道的CTLV编码外壳蛋白基因序列(登录号:FJ223212)设计一对特异引物:CP-F (5' -TTGgfi^r<XATGAGTTTGGAAGACGTGCT~3'，划线部分为 Bam/7 / 酶切位点和 CP-R (5' -TAAAG^TTCTAACCCTCCAGTTCC-3'，划线部分为Xho I酶切位点)，并由上海英骏生物技术有限公司合成。利用Trizol法提取柑橘病样的总RNA，以总RNA为模板，进行反转录，37°C，15min逆转录反应后，98°C 5min灭活酶后将cDNA保存于4°C或者_20°C待用。以cDNA为模板进行PCR反应，即上述反转录的cDNA模板?μL，5XPrimeSTARTM Buffer (含Mg2+)ΙΟμΙ,?ΝΤΡ Mix 4μ1,PrimeSTARTM DNA PolymeraseC2.5 U/μ L)0.5μ1，上下游引物各 ?μL，最后加无菌双蒸水补足反应终体积为50μ1。PCR反应参数如下:预变性94°C 2 min,变性940C 30 S，退火54°C 45 s,延伸72°C 45 s，循环扩增35次，最后72°C延伸10 min。扩增产物于0.8%琼脂糖凝胶进行电泳分析，并用PCR凝胶回收试剂盒(AxyGEN)回收DNA片段，具体操作参照产品试剂盒说明书进行。将纯化的PCR产物末端加A与克隆载体pMD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C5，其特征在于能分泌抗柑橘碎叶病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株6C5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8779。

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C5，其特征在于能分泌抗柑橘碎叶病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株6C5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8779。2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株6C5分泌的抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10'抗体类型及亚类为IgGl、kappa链，该单克隆抗体能与柑橘碎叶病毒27kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，周雪平，宋西娇，洪健，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33