凝结芽孢杆菌FM603产生的细菌素及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种细菌素及其制备方法，所述细菌素由保藏号为CGMCC NO.10221的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FM603产生，对革兰氏阳性病原菌如单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、抗甲氧西林金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌和坚强梭菌等具有抗菌活性。该细菌素分子量4276.45Da，部分氨基酸序列为Ala-Gly-His-Dhb-Phe-Val-Dhb-Gly-Pro，在热、酸、胃蛋白酶或胰蛋白酶的处理下较为稳定，易被链霉蛋白酶降解失活。本发明专利技术细菌素可作为微生物饲料添加剂应用，能够提高蛋鸡的产蛋率、降低料蛋比，改善蛋品质；提高仔猪采食量和日增重，降低料肉比；提高肉鸡日增重和血清溶菌酶含量，降低料肉比和死亡率。

【技术实现步骤摘要】
凝结芽孢杆菌FM603产生的细菌素及其制备方法
本专利技术涉及微生物及其培养和应用技术，具体涉及一种由凝结芽孢杆菌FM603产生的细菌素以及该细菌素的制备方法。
技术介绍
抗生素是微生物产生的次级代谢产物，对其它微生物具有抗菌活性。20世纪40年代，科学家们发现饲喂动物低剂量的抗生素可以改善动物的生产性能，提高经济效益。在之后的几十年内，抗生素广泛的应用于畜牧养殖行业，添加于饲料中用作生长促进剂，或者在养殖现场用作治疗药剂。抗生素的使用显著的提高了动物的生长效率和饲料转化率，对畜牧行业的发展起到了重要的作用。但是抗生素的使用也带来了诸多问题，比如耐药细菌的传播、二次感染及动物产品中的药物残留等。耐药菌的出现严重的威胁到人类健康，以抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌为例，感染该抗药菌株的死亡率是普通菌株的三倍，而且治疗费用和住院时间也增加很多。在美国和英国，约有40-60％的金黄色葡萄球菌具有甲氧苯青霉素抗性，在中国，约60-70％的大肠杆菌对氟喹诺酮类抗生素不敏感。大量使用抗生素，并违反停药期规定则容易导致动物产品中的药物残留超标，这样的动物产品很难进入国际市场，也会对人的健康存在潜在威胁。近些年来我国食品安全事故时有报道，2013年初的速生鸡事件和禽流感的爆发给家禽养殖行业带来了巨大损失，消费者们对畜牧养殖行业的关注也日渐增多，如何保证动物的高生产性能，同时生产出安全的肉、蛋、奶产品，关系到畜牧养殖行业的持续稳定发展。欧盟于2006年全面禁止抗生素作为生长促进剂添加在饲料中，韩国也于2011年禁用了抗生素类生长促进剂。中国如今也面临着是否禁止饲料中添加抗生素的问题，这也促使饲料和养殖企业，以及农牧院校的研究人员积极致力于生物制剂的开发和使用，以减少或者替代抗生素的应用。芽孢杆菌是革兰氏阳性、产芽孢的一类杆菌，广泛的存在于自然界中。芽孢杆菌在一定条件下可以转化为芽孢形式，芽孢对外界不良环境如高温、高压、紫外线等有极强的抵抗力。芽孢杆菌在工业上用作淀粉酶和蛋白酶的生产菌种，也长期的用于发酵类食品的制作。芽孢杆菌有益于食物的消化和肠道健康，能够促进动物的生产性能，因此也用作食品补充剂和动物益生菌。大量的研究数据表明，芽孢杆菌能够提高动物的生产性能，减少病原菌感染几率，提高动物机体免疫，降低养殖环境的氨气浓度，是抗生素类生长促进剂的良好替代品。芽孢杆菌通过刺激动物肠绒毛发育，提高非特异性免疫，产生抗菌活性物质发挥作用。细菌素是芽孢杆菌产生的抗菌活性物质之一，是微生物通过核糖体合成的多肽类抗菌物质，对很多病原菌包括耐药菌具有良好的抗菌活性。芽孢杆菌能够产生细菌素类抗菌物质，如subtilin、sublancin、subtilosin、lichenin等。细菌素是益生菌的重要功能性物质，考克大学的研究人员发现，产细菌素的乳酸菌可以有效的减少单核增生李斯特菌对小鼠的感染，但是在单核增生李斯特菌获得该细菌素的免疫基因后，乳酸菌失去对小鼠的保护功能。有研究表明，细菌素可以降低动物肠道中的葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酸酶活性，促进肉鸡增重，提高生产性能，机理与抗生素相似。因此，相比起普通芽孢杆菌，产细菌素的芽孢杆菌对动物的生产性能具有更为良好的促进作用，在实际生产中具有更大的应用潜力。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种由凝结芽孢杆菌FM603产生的细菌素。凝结芽孢杆菌FM603发酵培养产生细菌素，对革兰氏阳性细菌具有良好的抗菌作用。该细菌素分子量为4276.45Da，部分氨基酸序列为Ala-Gly-His-Dhb-Phe-Val-Dhb-Gly-Pro。本专利技术的另一目的是提供一种细菌素的制备方法，包括如下步骤：1)发酵上清液制备：将凝结芽孢杆菌FM603接种于10mL液体LB培养基培养过夜，将1mL培养液接种于1000mL改良胰蛋白胨培养基，200rpm，30℃培养20h，10000rpm离心除去菌体，得到发酵上清液；2)细菌素粗提液制备：将离子柱用50mM、pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡，发酵上清液以50mL/min的流速通过离子柱，将通过离子柱的上清液弃去，用磷酸盐缓冲液冲洗离子柱后，以含1MNaCl的磷酸盐缓冲液(50mM，pH6.5)洗脱离子柱，流速为10mL/min，收集洗脱液100mL，将洗脱液通过C18固相萃取柱，用100％的乙腈洗脱固相萃取柱并收集洗脱液，将洗脱液冷冻干燥后，溶解在50mM、pH6.5的磷酸盐缓冲液中，过滤后得到类细菌素粗提液；3)细菌素的纯化：类细菌素粗提液用高效液相色谱纯化，使用C18反相柱(250mm×10mm,5μ粒径)，流动相分别为A：100％乙腈，B：水，上样量为100μL，洗脱时间为40分钟，流速为1mL/min，收集每分钟洗脱的溶液，重复多次上样纯化后将相同时间点的洗脱液合并，冷冻干燥后溶于50mM磷酸盐缓冲液，并检测洗脱液的抗菌活性，以Listeriainnocua为指示菌，获得纯化的细菌素。与已报道的芽孢杆菌细菌素相比，FM603生产的细菌素在生物学特性及抗菌活性方面存在较大区别。FM603产生的细菌素对热、酸稳定，在60-70℃水浴10分钟保持90％以上活性，在80-100℃水浴10分钟保持80％活性；在pH2-8范围内处理2h活性损失小于10％，在pH9-10范围内处理2h活性存留60％。该细菌素在胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶处理1h后活性存留率大于90％，链霉蛋白酶处理1h后剩余20％活性(详细见表2)。该细菌素对革兰氏阳性致病菌如金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和耐药菌如抗甲氧西林金黄色葡萄球菌具有很强的抗菌活性(抑菌圈直径>20mm)，对厌氧产芽孢梭菌如产气荚膜梭菌和坚强梭菌具有较强的抗菌活性(抑菌圈直径17-18mm)，对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌、耶尔森菌，革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳杆菌以及酵母菌无抗菌活性，对霉菌如黄曲霉菌具有一定抗菌活性(详细见表3)。本专利技术纯化的细菌素经SDS-PAGE电泳分析，凝胶4500Da处有一条蛋白条带，将凝胶切下来进行抗菌活性检测，结果表明，该蛋白对李斯特菌有明显的抗菌活性。FM603细菌素经基质辅助激光解吸飞行时间质谱和串联质谱分析，分子量为4276.45Da，部分氨基酸序列为Ala-Gly-His-Dhb-Phe-Val-Dhb-Gly-Pro。该细菌素能改变革兰氏阳性菌细胞膜膜电位和通透性，导致细胞内钾离子外流，从而杀灭细菌。本专利技术提供的细菌素经提取纯化后可直接应用于制备饲料添加剂。也可以将本专利技术细菌素的产生菌凝结芽孢杆菌FM603或其发酵培养物应用于制备饲料添加。本专利技术所述凝结芽孢杆菌FM603，该菌株已于2014年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，保藏号为CGMCCNO.10221。本专利技术菌株FM603在常温和常规培养基上生长良好，菌落在胰蛋白胨琼脂上呈白色，不规则，表面粗糙。革兰氏染色阳性，产芽孢。将该菌的16SrRNA序列在美国国家生物技术信息中心(N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由凝结芽孢杆菌产生的细菌素，其特征在于，所述细菌素是分子量为4276.45Da的蛋白类抑菌物质，所述凝结芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC NO.10221。

【技术特征摘要】
1.一种由凝结芽孢杆菌产生的细菌素，其特征在于，所述细菌素是分子量为4276.45Da的蛋白类抑菌物质，所述凝结芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNO.10221；所述细菌素的制备方法包括如下步骤：(1)发酵上清液制备：将凝结芽孢杆菌CGMCCNO.10221接种于10mL液体LB培养基培养过夜，将1mL培养液接种于1000mL改良胰蛋白胨培养基，200rpm，30℃培养20h，10000rpm离心除去菌体，得到发酵上清液；(2)细菌素粗提液制备：将离子柱用50mM、pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡，发酵上清液以50mL/min的流速通过离子柱，将通过离子柱的上清液弃去，用磷酸盐缓冲液冲洗离子柱后，以50mM，pH6.5含1MNa...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭耀棋，丁毅，王丽娟，曹岩峰，唐日益，
申请(专利权)人：沈阳丰美生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21