本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了靶向IFNAR2基因的RNA干扰表达载体构建及应用。本发明专利技术的方法是将筛选得到的靶向IFNAR2基因的siRNA寡核苷酸片段插入到载体系统中，构建成靶向IFNAR2基因的RNA干扰质粒载体。实验表明，本发明专利技术构建的表达载体可以在ST细胞中高效表达特异的siRNA序列，且该序列能够结合IFNAR2基因的mRNA，使IFNAR2基因的表达量显著降低，达到抑制IFNAR2基因表达的目的。为进一步研究IFNAR2基因的生物学功能提供更加可靠和便捷的研究手段，同时为研究IFNAR2受体在病毒感染中的作用奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
靶向IFNAR2基因的RNA干扰表达载体构建及应用
本专利技术属于分子生物学领域，特别涉及靶向IFNAR2基因的RNA干扰表达载体构建及应用。
技术介绍
干扰素的抗病毒作用是干扰素分子结合到干扰素受体之后，向细胞核传播信号，2，5-腺苷酸合成酶和蛋白激酶被活化，最后阻断病毒蛋白的翻译和病毒RNA的合成。干扰素受体是干扰素连锁反应的初始蛋白。人的干扰素受体分I型干扰素受体(该受体与干扰素α、β结合)及II型干扰素受体(与干扰素Y结合产生特异的敏感性)。此外，已证实II型干扰素受体对干扰素α、β也有一定的敏感性，干扰素α亚型和β亚型均对干扰素受体敏感。IFN生物效应的发挥，需要跟相应的信号受体结合。根据IFN的分类，干扰素受体分为:结合I型干扰素的I型干扰素受体和结合II型干扰素受体。人I型干扰素受体基因定位于第21号染色体上，分布于细胞表面，至少含有两个亚单位，命名为a (IFNAR-1)和β (IFNAR-2)，它们属于II类细胞因子受体家族。IFN-α/β通过吸附细胞表面受体IFNAR-1和IFNAR-2发挥作用，蛋白酪氨酸激酶中的Tyk2和Jakl分别与IFNAR-1和IFNAR-2 相关。为了更好地解析IFNAR2基因的生物学功能和挖掘其在临床上的应用价值，进一步阐明IFNAR2基因的生物学功能成为必要。目前，运用RNA干扰的方法研究基因功能成为了基因功能研究中最重要的手段之一，但是针对IFNAR2基因干扰的研究尚未见任何指导。RNA干扰(RNA interference，缩写为RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。RNAi现象在生物中普遍存在。RNAi所诱导的特异性基因沉默现象，是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解。对果蝇的研究证明，长度为21~23nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA) ?目前获得siRNA产物的方法主要包括以下五种:1)化学合成；2)体外转录；3)RNase III降解dsRNA ；4) siRNA表达载体；5)PCR表达框。在以上方法中，化学合成、体外转录和RNase III降解dsRNA均是在体外制备得到siRNA，siRNA需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将siRNA转染进入细胞是成功的关键。siRNA表达载体可以在克隆菌株中大量扩增，还可以使用常规的质粒DNA转染方法，将siRNA表达载体转染入细胞，在细胞内加工生成siRNA。而且siRNA表达载体是唯一可以进行长期研究的方法，因该方法中克隆到的带抗生素标记的载体可以在细胞中持续表达，进而抑制靶基因的表达，持续时间久，并且可以做稳定细胞系的筛选。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供靶向IFNAR2基因的siRNA。本专利技术通过大量筛选和实验工作得到靶向IFNAR2基因的siRNA。本专利技术的另一目的在于提供表达siRNA的表达载体。本专利技术的另一目的在于提供上述表达载体的构建方法。本专利技术的再一目的在于提供上述siRNA及表达载体在抑制IFNAR2基因表达中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:靶向IFNAR2基因的siRNA，其编码所述siRNA的DNA序列选自如下核苷酸序列:siEl:5/ -CTAACAGATGTGTGGATAA-3' (SEQ ID N0.7)；siE2:5/ -CGAATAAAGGGAAACATCA-3' (SEQ ID N0.8)；siE3:5/ -GATGAATCTTGCACTTTAA-3' (SEQ ID N0.9)；进而，根据上述siRNA的DNA序列设计合成shRNA，其是将上述siRNA的DNA序列与其互补序列用loop结构连接作为正义链，其互补序列作为反义链，形成双链结构；为了便于插入表达载体，还可以在该序列两端分别接上接头序列，最终形成诸如SEQ ID N0.1和2，SEQ ID N0.3和4，或SEQ ID N0.5和6退火形成的双链shRNA ；进一步，本专利技术提供含有上述siRNA或shRNA的siRNA表达载体；在本专利技术优选的实施方式中，所述表达载体源自pSilencer4.1-CMV neo ;构建得到表达载体为pSiCMVEl、pSiCMVE2 和 pSiCMVE3。本专利技术还提供构建上述siRNA表达载体的方法，其包括如下步骤:(I)将上述siRNA的DNA序列和其互补序列用loop结构序列连接形成正义链，在正义链的两端引入接头序列；(2)根据步骤(1)的正义链得到其反义链，并在其两端引入接头序列；(3)将步骤⑴和⑵得到的序列在溶液中退火，形成shRNA ；(4)将shRNA插入线性化的siRNA表达载体中，得到表达siRNA的表达载体。在本专利技术实施方式中，步骤(1)中所述的5'引入的接头序列为5' -GATCC-3'，3'引入的接头序列为5' -TTA-3 / ;步骤(2)中所述的5'引入的接头序列为5' -AGCTTAA-3'，3'引入的接头序列为G ;所述loop结构序列为5' -TTCAAGAGA-3'。转染上述载体进入ST细胞，分别从RNA和蛋白水平检测这些质粒载体干扰IFNAR2基因表达的干扰效率，结果表明，上述构建的表达载体可以在ST细胞中高效表达特异的siRNA序列，且该序列能够结合IFNAR2基因的mRNA，使IFNAR2基因的表达量显著降低，达到抑制IFNAR2基因表达的目的；从而可以将上述siRNA、shRNA或上述表达载体用于IFNAR2基因的表达。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及效果:本专利技术中所得到的三种干扰IFNAR2基因表达的干扰质粒载体(pSiCMVEl、pSiCMVE2和pSiCMVE3)，具有在ST细胞(猪睾丸细胞)中特异性和高效性地干扰IFNAR2基因表达的能力，为进一步研究IFNAR2基因的生物学功能提供更加可靠和便捷的研究手段，同时为研究IFNAR2受体在病毒感染中的作用奠定了基础。【附图说明】图1是用于构建IFNAR2基因的RNAi干扰质粒载体的质粒系统pSilencer4.1-CMVneo示意图(引自Ambion公司提供的技术手册AM5779)。图2是siEl、siE2和siE3转化子的质粒提取检测的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M:DL5000DNA Marker ;泳道1:siEl转化子的独立克隆子的质粒本文档来自技高网...
【技术保护点】
靶向IFNAR2基因的siRNA，其特征在于：编码所述siRNA的DNA序列选自如下核苷酸序列：siE1:5′‑CTAACAGATGTGTGGATAA‑3′；siE2:5′‑CGAATAAAGGGAAACATCA‑3′；siE3:5′‑GATGAATCTTGCACTTTAA‑3′。
【技术特征摘要】
1.靶向IFNAR2基因的siRNA，其特征在于:编码所述siRNA的DNA序列选自如下核苷酸序列:siEl:5/ -CTAACAGATGTGTGGATAA-3'；siE2:5/ -CGAATAAAGGGAAACATCA-3'；siE3:5/ -GATGAATCTTGCACTTTAA-3'。2.针对IFNAR2基因的shRNA，其特征在于:编码所述shRNA的DNA序列为:SEQID N0.1和2，SEQ ID N0.3和4 ，或SEQ ID N0.5和6退火形成的双链。3.含有权利要求1所述的siRNA或权利要求2所述shRNA的siRNA表达载体。4.根据权利要求3所述的siRNA表达载体,其特征在于:其源自pSilencer4.1-CMVneo05.根据权利要求4所述的siRNA表达载体，其特征在于:其为pSiCMVEl、pSiCMVE2或pSiCMVE306.权利要求3~5任一项所述的siRNA表达载体的构建方法,其特征在于包括如下步骤: (1...
【专利技术属性】
技术研发人员：张建峰，沈海燕，张春红，郭鹏举，陈琴苓，卢宇，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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