产无糖雷莫拉宁的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开一种产无糖雷莫拉宁的基因工程菌，其是一种抑制或敲除了产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株中糖基转移酶基因的基因工程菌。本发明专利技术也公开所述基因工程菌的制备方法和所用的重组穿梭载体和转化体，以及这种产无糖雷莫拉宁的基因工程菌在生产无糖雷莫拉宁或雷莫拉宁衍生物上的应用。

【技术实现步骤摘要】
产无糖雷莫拉宁的基因工程菌及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体地说涉及一种生产无糖雷莫拉宁的游动放线菌的基因工程菌及其制备方法和所用的重组穿梭载体和转化体，以及这种产无糖雷莫拉宁工程菌在生产无糖雷莫拉宁和雷莫拉宁衍生物上的应用。
技术介绍
随着抗生素在抗感染治疗上的大量应用，临床耐药问题日益突出，雷莫拉宁(RAM0PLANIN)作为一类新型广谱抗革兰氏阳性菌抗生素，目前主要是作为外用和治疗胃肠道粘膜表面感染性疾病药物进行研究开发。雷莫拉宁由一种游动放线菌属菌种(美国标准菌库保存，保藏号ATCC33076)发酵制得，其发酵液中主要含有三种结构类似物，雷莫拉宁A1、A2和A3，其制备工艺及用途由US4427656公开，结构上，雷莫拉宁在Hpg11上连接有D-甘露糖基二糖，如图1所示，其中主要产物为雷莫拉宁A2。无糖雷莫拉宁A1、A2、A3(以下称为Ala、A2a和A3a)是一组在结构上缺失了 D-甘露糖基二糖的雷莫拉宁衍生物。US5491128公开了无糖雷莫拉宁Ala、A2a和A3a的制备方法，并显示其针对特定耐药病原菌的抗菌活性类似或稍强于雷莫拉宁Al、A2和A3 ;同时，无糖雷莫拉宁Ala、A2a和A3a也可作为雷莫拉宁结构改造的先导化合物；Jiang等报道了一种全合成 A2a 的方法，Total synthesis of the ramoplanin A2 andramoplanoseaglycon. Journal of the American Chemical Society 124.19(2002):5288-5290.；Shin 等人报道了全合成 Ala 和 A3a 的方法，Totalsynthesis and structure ofthe ramoplanin Al and A3 aglycons:Two minorcomponents of the ramoplanincomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 101.33(2004):11977-11979.;Palo 等人提到了一种酶法制备 Ala、A2a 和 A3a的方法 Anew bacterial mannosidase for the selective modification of ramoplaninandits derivatives.Enzyme and Microbial Technology 41.6 (2007):806-811。如果能够抑制或者敲除雷莫拉宁生物合成途径中的糖基转移酶，则所获的突变株可以通过常规的发酵分离手段直接制备无糖雷莫拉宁，从而避免了水解法和酶法制备工艺中需先制得雷莫拉宁后再对其进行相应化学处理或酶法处理以及随后的目标产物的分离纯化的重复工艺，也可以避免化学合成法的繁琐工艺。
技术实现思路
本专利技术通过阻断产雷莫拉宁菌株中的糖基转移酶基因，达到在其发酵过程中产生无糖雷莫拉宁的目的。因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对现有的水解法、酶法和化学全合成制备雷莫拉宁Ala、A2a和A3a的较为繁琐的工艺提供一种敲除糖基转移酶的产无糖雷莫拉宁的基因工程菌，该菌能够经由常规的发酵、分离工艺制备雷莫拉宁Ala、A2a和A3a，且传代非常稳定。本专利技术还提供了该生产雷莫拉宁Ala、A2a和A3a的基因工程菌的制备方法和所用的重组穿梭载体和转化体。本专利技术人经过仔细的研究和反复的对比发现，雷莫拉宁生物合成基因簇中的ramo-orf29所编码的0FR29的氨基酸序列与替考拉宁、A40926生物合成途径中的甘露糖基转移酶TCP15、DBV20类似，均含有甘露糖基转移酶的保守区域arnT，且RAM0-0RF29与TCP15和DBV20的一致性分别达到63%和50%，是雷莫拉宁生物合成途径中负责加载D-甘露糖基二糖的甘露糖基转移酶。因此，本专利技术人利用同源重组双交换将雷莫拉宁生物合成基因簇中的ram0-0rf29进行同框敲除操作，经由抗性筛选，所获得的突变株不再产生雷莫拉宁Al、A2和A3,转而产生雷莫拉宁Ala、A2a和A3a,从而完成了本专利技术。因此，本专利技术的第一个目的是提供一种产无糖雷莫拉宁的基因工程菌，其是一种抑制或敲除了产雷莫拉宁野生菌株中糖基转移酶基因的基因工程菌。根据本专利技术一个优选的实施方式，所述的糖基转移酶基因为产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ramo-orf29基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1的2727-4586位所示。其中，产雷莫拉宁野生菌株是指游动放线菌属菌种(美国标准菌库保存，保藏号ATCC33076)，或其突变菌株等。根据本专利技术，所述抑制或敲除产雷莫拉宁野生菌株中糖基转移酶基因ram0-0rf29是指将外来DNA片段插入ramo-orf29基因中，或与ramo_orf29基因中的DNA片段置换，从而使ramo-orf29被阻断而不能表达。所述的产雷莫拉宁野生型菌株的ramo_orf29基因序列被敲除的部分最大长度可以是整个ramo-orf29基因,较佳的是敲除ramo_orf29基因的第322位-723位之间的核苷酸片段；或敲除ramo-orf29基因的第457-1365位之间的核苷酸片段；或敲除ramo-orf29基因的第937-1788位之间的核苷酸片段。因此，ramo-orf29基因被阻断而不能表达，从而使该被改造了的产雷莫拉宁野生型菌株失去产雷莫拉宁的能力转而产生无糖雷莫拉宁。根据本专利技术，所述的游动放线菌属菌种较佳的选用国内工业用菌株——Actinoplanes sp.ATCC 33076。本专利技术的第二个目的是提供一种重组穿梭载体，其含有在产雷莫拉宁野生型菌株中与ramo_orf29基因连锁的上游基因或其片段、ramo_orf29基因5’端片段、ramo-orf29基因3’端片段以及ram0-0rf29基因连锁的下游基因或其片段依次连锁组成的DNA片段。雷莫拉宁生物合成基因簇的核苷酸序列已经由US 7635765公开。在野生型产雷莫拉宁菌株中，基因 ramo-orf29 上游的 ramo_orf28、ramo_orf27、ramo_orf26 依次连锁表达，ramo-orf29> ramo-orf30> ramo-orf31依次连锁表达。核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。其中第1-1764位核苷酸序列是所述的ramo-orf26基因片段；第1822-2049位核苷酸序列是所述的ramo-orf27基因片段；第2202-2486位核苷酸序列是所述的ramo-orf28基因，第2727-4586位核苷酸序列是所述的ramo-orf29基因，第4621-5688位核苷酸序 列是所述的ramo-orf30基因，第5695-6984位核苷酸为所述的ramo-orf31基因。ramo_orf29基因中被敲除部分的长度最大可以是整个ramo_orf29,较佳的是ramo-orf29基因中间的核苷酸序列，更佳的是ramo_orf29中编码甘露糖基转移酶保守区域arnT的核苷酸序列。也就是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产无糖雷莫拉宁的基因工程菌，其是一种抑制或敲除了产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株中糖基转移酶基因的基因工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种产无糖雷莫拉宁的基因工程菌，其是一种抑制或敲除了产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株中糖基转移酶基因的基因工程菌。2.如权利要求1所述的基因工程菌，所述糖基转移酶基因为产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ramo-orf29基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1的2727-4586位所示。3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株是游动放线菌 Actinoplanes sp.ATCC 33076。4.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ramo-orf29基因被全部抑制或敲除。5.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ram0-0rf29基因的第322-723位的核苷酸片段被抑制或敲除。6.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ramo-orf29基因的第457-1365位的核苷酸片段被抑制或敲除。7.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述产雷莫拉宁的游动放线菌野生菌株的ram0-0rf29基因的第 937-1788位的核苷酸片段被抑制或敲除...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈代杰，李继安，陈俊升，王元希，邵雷，林惠敏，蓝鸿，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海;31