生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法技术

在一个方面，本发明专利技术提供了一种生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法，所述方法包括所述重组酶在真核宿主细胞中的细胞内表达的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能够水解叶绿素和叶绿素衍生物的酶的生产。 
技术介绍
叶绿素是一种绿色色素，其广泛发现于整个植物界，多存在于藻类和蓝藻细菌中。叶绿素是光合作用所必需的，并且是地球上发现的最丰富的有机金属化合物之一。因而许多来自植物的产品(包括食物和饲料)含有相当多的叶绿素。 例如，得自含油种子(例如大豆、棕榈种子或油菜籽(卡诺拉油菜)、棉籽、葵花籽、葡萄籽和花生)的植物油通常含有一些叶绿素。然而，通常不期望植物油中存在高含量的叶绿素色素。这是因为叶绿素使油带上难看的绿色，并且在储存期间可引起油的氧化，从而导致油的变质。 已采用各种方法以除去植物油中的叶绿素。在产油过程的多个阶段，包括种子破碎、油萃取、脱胶、碱处理和漂白步骤，都可除去叶绿素。然而，漂白步骤通常对于将叶绿素残留量降至可接受含量是最为有效的。在漂白期间，加热油并使其通过吸附剂以除去叶绿素和影响成品油外观和/或稳定性的其他有色化合物。用于漂白步骤的吸附剂通常为粘土。 在可食用油加工行业中，采用上述步骤通常会将加工油中的叶绿素含量降至介于0.02至0.05ppm之间。然而，漂白步骤由于漂白粘土的夹带作用会增加加工成本和降低油产量。粘土的使用可能会将许多有用的化合物(例如类胡萝卜素和生育酚)也从油中除去。另外粘土的使用也很昂贵，这尤其是因为用过的粘土(即废料)的处理困难、危险(易于自燃)，因而处理成本高。因而已进行了用其他办法从油中除去叶绿素的尝试，例如使用叶绿素酶。 在植物中，叶绿素酶(chlorophyllase或chlase)被认为参与叶绿素降解，并催化叶绿素中酯键的水解而生成脱植基叶绿素和叶绿醇。WO 2006009676描述了可降低组合物中叶绿素污染的一种工业方法，例如用叶绿素酶处理植物油。此方法中产生的水溶性脱植基叶绿素也是绿色，但是可通过水萃取法或二氧化硅处理除去。 叶绿素通常在用于产油的种子中以及从种子提取油的过程中部分降解。一种常见的修饰为卟啉(二氢卟酚)环失去镁离子形成称为脱镁叶绿素的衍生物(参见图1)。卟啉环上高极性镁离子的丢失导致脱镁叶绿素与叶绿素相比在理化性质上显著不同。通常在加工过程中，油中的脱镁叶绿素比叶绿素含量更丰富。脱镁叶绿素呈淡绿色，可通过与用于叶绿素类似的方法从油中除去，例如WO 2006009676中所述通过由具有脱镁叶绿素酶活性的酶催化的酯酶反应。在某些条件下，一些叶绿素酶能够水解脱镁叶绿素以及叶绿素，因此适于除去这两种污染物。脱镁叶绿素水解的产物为红色/褐色的脱镁叶绿酸和叶绿醇。脱镁叶绿酸也可由脱植基叶绿素(即叶绿素水解之后)失去镁离子生成(参见图1)。WO 2006009676教导了通过与脱植基叶绿素类似的方法(例如通过水萃取法或二氧化硅吸附)除去脱镁叶绿酸。 脱镁叶绿素还可通过含油种子收获和储存期间植物酶的活性或者通过精制油期间的加工条件(即热)进一步降解为焦脱镁叶绿素(参见“Behaviour of Chlorophyll Derivatives in Canola Oil Processing”，JAOCS，Vol，no.9(Sept.1993)pages 837-841(“卡诺拉油加工过程中叶绿素衍生物的行为”，《美国油脂化学协会杂志》，第9卷，1993年9月，第837-841页))。一种可能的机制是脱镁叶绿素碳环上甲酯键的酶水解，然后不稳定中间体向焦脱镁叶绿素的非酶转化。据报道来自藜(Chenopodium album)的名为脱镁叶绿酸酶的28-29kDa酶能够催化脱镁叶绿酸上类似的反应，以产生不含叶绿醇的焦脱镁叶绿素衍生物，称为焦脱镁叶绿酸(参见图1)。焦脱镁叶绿酸比脱镁叶绿酸极性低，导致焦脱镁叶绿酸与脱镁叶绿酸相比具有降低了的水溶解度和增加了的油溶解度。 取决于加工条件，在加工期间植物油中焦脱镁叶绿素可比脱镁叶绿素和叶绿素含量都更为丰富(参见表9中的Bailey’s工业用油和脂肪产品(2005年)的2.2卷，第6版，Fereidoon Shahidi、John Wiley和Sons编辑)。这部分地是由于在植物材料的收获和储存期间叶绿素中镁的丢失。如果使用90℃或更高温度下的长时间热处理，油中焦脱镁叶绿素的量可能会 增加并且可能高于脱镁叶绿素的量。也可通过在压榨和萃取之前加热含油种子以及精制过程中油脱胶和碱处理降低叶绿素含量。还观察到油中的磷脂可与镁络合，从而降低叶绿素的量。因而在许多植物油中与焦脱镁叶绿素(和脱镁叶绿素)相比，叶绿素为相对少量的污染物。 因而需要大规模生产叶绿素酶和相关酶，特别是用于炼油的方法。来自普通小麦(Triticum aestivum)(小麦(wheat))的叶绿素酶已在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组地表达，如在Arkus et al(2005)，Arch.Biochem.Biophys 438：146-155(Arkus等人，2005年，《生物化学与生物物理学集刊》，第438卷，第146-155页)中所述。然而，通过此细菌表达方法获得的重组叶绿素酶的产率较低，通常为大约每升几毫克。 仍然需要一种用于生产叶绿素酶和相关酶，特别是用于适合在植物油精炼中使用的酶的快速大规模表达的改进的方法。 
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了一种优选以高收率生产能够水解叶绿素或一种或多种叶绿素衍生物的重组酶的方法，其包括在宿主细胞(例如，微生物和/或真核宿主细胞)中进行细胞内表达重组酶的步骤。所述宿主细胞通常为真核生物，包括酵母，例如，酵母属(Saccharomyces sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp)、汉逊酵母属(Hansenula)和丝状真菌，例如曲霉菌属(Aspergillus sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)以及金孢子菌属(Chrysosporium)。 在一个实施例中，所述宿主细胞为真菌细胞，例如木霉属(Trichoderma)、曲霉菌属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、酵母属、镰刀菌属。优选宿主细胞来自木霉属，例如，里氏木霉(Trichoderma reesei)。 在具体的实施例中，该重组酶具有叶绿素酶、脱镁叶绿素酶和/或焦脱镁叶绿素酶活性，例如，叶绿素酶活性。 重组酶可包括选自GHSXGG(SEQ ID NO：36)、DPVXG(SEQ ID NO：37)和YGHXD(SEQ ID NO：38)的一种、两种或三种氨基酸序列。 在一些实施例中，编码重组酶的基因来自植物，例如，拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甘蓝(Brassica oleracea)、蓖麻(Ricinus communis)、银杏(Ginkgo biloba)、毛果杨(Populus trichocarpa)、葡萄(Vitis vinifera)、毛 竹(Phyllostachys heterocycla)、高粱(Sorghum bicolor)、橹豆(Glycine max)、发财树(Pachira macrocarpa)、普通小麦(Triticum aestivum)、甜橙(Citru本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法，其包括所述重组酶在真核宿主细胞中的细胞内表达的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.02.23 US 61/445,6571.一种生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法，其包括
所述重组酶在真核宿主细胞中的细胞内表达的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞为真菌细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述宿主细胞来自木霉属
(Trichoderma)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组酶为叶绿素
酶。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶包括选自
GHSXGG(SEQ ID NO：36)、DPVXG(SEQ ID NO：37)和YGHXD
(SEQ ID NO：38)的一个或多个氨基酸序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组酶来自拟南
芥(Arabidopsis thaliana)、甘蓝(Brassica oleracea)、蓖麻(Ricinus 
communis)、银杏(Ginkgo biloba)、毛果杨(Populus trichocarpa)、葡萄
(Vitis vinifera)、毛竹(Phyllostachys heterocycla)、高粱(Sorghum 
bicolor)、橹豆(Glycine max)、发财树(Pachira macrocarpa)、普通小麦
(Triticum aestivum)、甜橙(Citrus sinensis)、玉米(Zea mays)、藜
(Chenopodium album)、北美云杉(Picea sitchensis)或莱茵衣藻
(Chlamydomonas reinhardtii)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组酶包含如在
SEQ ID NO：1至18的任意一个中所定义的多肽序列或其功...

【专利技术属性】
技术研发人员：SM马德赫，
申请(专利权)人：杜邦营养生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK