不含叶绿醇的叶绿素衍生物的检测分析法制造技术

本发明专利技术提供检测样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的方法，所述方法包括检测与所述不含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号，其中所述样品中与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号被猝灭。所述方法可用于对样品中的叶绿素酶和相关酶的活性进行定量，而不用对底物和产物进行溶剂分提。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及检测样品中的叶绿素衍生物的方法。该方法可用在测定样品中叶绿素酶或相关酶的活性的检测分析法。
技术介绍
叶绿素是在整个植物界广泛存在的一种绿色色素。叶绿素是光合作用所必需的，并且是地球上发现的最丰富的有机金属化合物之一。因而许多来自植物的产品(包括食物和饲料)含有相当多的叶绿素。在植物中，叶绿素酶(chlorophyllase或chlase)被认为参与叶绿素降解，并催化叶绿素中酯键的水解而生成脱植基叶绿素和叶绿醇。作为另外一种选择,可通过从卟啉(二 氢卟酚)环失去镁离子使叶绿素发生降解，形成名为脱镁叶绿素的衍生物(参见图5)。在某些条件下，一些叶绿素酶还能水解脱镁叶绿素，产生脱镁叶绿酸和叶绿醇。脱镁叶绿酸也可通过从脱植基叶绿素(即叶绿素水解之后)失去镁离子而产生(参见图5)。脱镁叶绿素可进一步降解为焦脱镁叶绿素。一种可能的机制是脱镁叶绿素碳环上甲酯键的酶水解，然后不稳定中间体向焦脱镁叶绿素的非酶转化。据报道，来自藜(Chenopodium album)的名为脱镁叶绿酸酶的28_29kDa酶能够催化脱镁叶绿酸上类似的反应，产生不含叶绿醇的焦脱镁叶绿素衍生物，称为焦脱镁叶绿酸(参见图5)。焦脱镁叶绿素也可由某些酶水解，形成焦脱镁叶绿酸和叶绿醇。已开发出多种检测分析法来测定样品中的叶绿素酶活性(参见例如Khamessanet al. (1994), Journal of Chemical Technology&Biotechnology,Vol.60 (I), pages 73-81 (Khamessan等人,1994年，《化学技术与生物技术杂志》，第60卷第I期第73-81页))。测定叶绿素酶活性的最广泛使用的方法由Klein和Vishniac在J. Biol.Chem. 1961236:2544-2547 (《生物化学杂志》，1961年，第236卷第2544-2547页)中进行了描述。该方法涉及在含丙酮的水性缓冲体系中测定酶活性。加入丙酮是为了确保底物(叶绿素)的溶解。酶反应发生后，将残余的底物萃取到己烷中。反应产物脱植基叶绿素由于失去了叶绿醇链，其亲水性比叶绿素更高。因此，脱植基叶绿素仍留在水/丙酮相中，然后便可通过分光光度计测量法进行定量。虽然已对此方法的多种改良方案进行了描述，但所有已公布的方法均涉及反应产物的己烷分提步骤。此步骤是必需的，因为使用光谱技术难以区分叶绿素和脱植基叶绿素。己烷萃取后，底物和反应产物将处于不同的相中，因此对任一者的测量均可用于测定酶的活性。然而，己烷分提过程费力又麻烦，并不非常适合用于叶绿素酶活性的高通量筛选(HTS)方法。Arkus 等人在 Analytical Biochemistry 353 (2006) 93 - 98(《分析生物化学》，2006年，第353卷第93 - 98页)中报道了尝试克服在叶绿素酶的高通量筛选中己烷萃取方面的问题。此检测分析法不再使用叶绿素作为底物，而是采用对硝基苯酯作为叶绿素酶高通量筛选中的人工底物。遗憾的是，此方法并不是很可靠，因为某些叶绿素酶虽然对叶绿素的活性很高，但是对于对硝基苯酯的活性相当低，可能会产生假阴性结果。此外，微生物叶绿素酶往往与其他酯酶共同表达，这些酶可作用于对硝基苯酯但不会作用于叶绿素，因此会得到假阳性结果。因而，仍需要叶绿素酶和相关酶的改进检测分析法。具体地讲，需要一种避免溶剂萃取的不足而又可靠、准确并适于高通量筛选的方法。
技术实现思路
因此，本专利技术提供检测样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的方法，该方法包括检测与不含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号的步骤，其中与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号被猝灭。在一个实施例中，与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物相关的荧光信号通过叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的二聚化而猝灭。优选地，在检测步骤中所用的条件下，叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物比不含叶绿醇的叶绿素衍生物优先二聚化。 在一个实施例中，不含叶绿醇的叶绿素衍生物包括脱植基叶绿素、脱镁叶绿酸或焦脱镁叶绿酸。在一个实施例中，叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物包括叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。可在含表面活性剂、醇和碱的检测溶液中执行检测步骤。优选地，该醇包括异丙醇，更优选地为12至20重量％的醇。在一个实施例中，该表面活性剂的含量按检测溶液的总重量计为O. 01至O. 03重量％，优选地包括4-(1，1,3, 3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇。在一个实施例中，该检测步骤在20至25°C并优选地在大于10. O的pH值下进行。可在例如约670nm处检测突光信号。在一个实施例中，叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物以二聚体和/或其他非胶态多聚体的水溶液形式存在。在一个实施例中，该检测步骤在不存在脂质体的情况下进行。在一个实施例中，表面活性剂包括4- (1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇，醇包括异丙醇，而碱包括氢氧化钠。在另一方面，本专利技术提供定量样品中的酶活性的检测分析方法，其中该酶能够水解叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物，该检测分析方法包括a)将样品与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物接触；和b)通过上述方法检测不含叶绿醇的叶绿素衍生物的产生情况。在一个实施例中，步骤(a)包括将样品与叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物在含有表面活性剂、丙酮和/或缓冲液的反应溶液中进行温育。优选地，在步骤(a)之后并在步骤(b)之前，将反应溶液加到如上所定义的检测溶液中以终止酶活性。在一个实施例中，该酶在步骤(a)中具有活性，而在步骤(b)中无活性。在另一个方面，本专利技术提供用于定量样品中的酶活性的试剂盒，其中该酶能够水解叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物，该试剂盒包含a)反应溶液，该酶在其中具有活性；b)底物，其包含叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物；以及c)检测溶液,该底物在其中比该酶产生的不含叶绿醇的叶绿素衍生物优先发生二聚化。在一个实施例中，该反应溶液包含表面活性剂、丙酮和缓冲液。优选地，该底物包括叶绿素、脱镁叶绿素或焦脱镁叶绿素。该检测溶液可为如上所述的检测溶液。优选地，该酶在该检测溶液中无活性。在一个实施例中，试剂盒还包含一种或多种标准溶液，每种标准溶液均包含已知浓度的不含叶绿醇的叶绿素衍生物。附图说明图I示出了由两个脱镁叶绿素分子形成二聚体的过程。二聚化通过卟啉(二氢卟酚)环发生，并导致670nm处的荧光猝灭。图2示出了相对荧光(RFU)与焦脱镁叶绿酸浓度(PM)的标准(校准)曲线。图3示出了相对荧光(RFU)与脱镁叶绿酸浓度(PM)的标准(校准)曲线。图4示出了脱镁叶绿素在脱镁叶绿素酶的催化作用下水解生成脱镁叶绿酸和叶绿醇。图5示出了涉及叶绿素和衍生物的反应以及可通过本专利技术进行检测的酶活性。具体实施例方式在一个方面，本专利技术涉及检测样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的方法。通过猝灭样品中衍生自叶绿素或含叶绿醇的叶绿素衍生物的荧光信号，可直接检测不含叶绿醇的叶绿素衍生物。该方法可用于定量，即，可使用该方法来测定样品中不含叶绿醇的叶绿素衍生物的水平或浓度。因此，该方法尤其可用于测定样品中叶绿素酶或相关酶的活性，因为它无需进行物理分离便可将产物与底物区分开(即，无需对底物和产物进行己烷萃取或其他溶剂分提)。叶绿素和叶绿素衍牛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R米克尔森，T约根森，JB索厄，
申请(专利权)人：杜邦营养生物科学有限公司，
类型：
国别省市：