【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物技术,特别是一种胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建。
技术介绍
1988年,Rousselet等发现神经胶质细胞的条件培养液具有神经营养作用,1993年美国华裔科学家Lin等从神经胶质瘤细胞条件培养液中纯化了这种具有神经营养作用的蛋白质,克隆其基因并将之命名为胶质细胞源生神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor, GDNF)。随后的大量研究表明,GDNF不仅对多巴胺能神经元具有很强的促存活作用,而且对运动神经元、去甲肾上腺素神经元、外周感觉神经元和交感神经元都有很强的促存活作用;而且GDNF对发育中的运动神经元也有良好的营养作用。GDNF对运动神经元的作用在迄今发现的所有神经营养因子中是活性最强的一个,可以促进运动神经元的存活、分化及代谢功能,对胚胎期或出生后损伤的运动神经元都有很强的修复作用。GDNF的这种对运动神经元所具有的修复损伤作用,为运动神经元性疾病(如脊髓损伤)的治疗开辟了新途 径。然而,⑶NF是一种生物大分子,难以通过血脑屏障,因而很难直接转移到中枢神经系统。此外尽管GDNF在哺乳动物体内分布较广,但其含量甚微,因此我们利用基因工程的方法以期获得高产量的活性因子用于脊髓损伤的治疗。长期以来,许多神经系统疾病如脊髓损伤、帕金森氏综合症、脊髓侧束硬化症等的治疗是临床攻克的难题。应用细胞因子直接注射(一次性治疗)或神经组织移植(细胞替换)疗效有限,且一些神经遗传性疾病以及需合适微环境的神经再生的治疗,仅用细胞介导疗法很难达到理想的效果。因此人们想通过 ...
【技术保护点】
胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建,其特征是:它按如下步序进行:(1)质粒转化大肠杆菌,将质粒pSK/GDNF和逆转录病毒表达载体pLNCX2分别加入感受态大肠杆菌,并抽提与纯化质粒DNA。(2)限制性内切酶消化,用限制性内切酶分别消化质粒pSK/GDNF或pLNCX2,并回收DNA。(3)目的基因与载体的连接、转化和克隆鉴定,将目的GDNF和载体pLNCX2大片段DNA在连接酶的作用下连接、转化大肠杆菌,并进行克隆鉴定。(4)重组逆转录病毒的包装,将质粒pLNCX2?GDNF转染包装细胞pT67,并筛选阳性克隆(暂时命名为pT67?GDNF)。(5)PCR鉴定重组逆转录病毒的包装,阳性克隆pT67?GDNF细胞基因组DNA进行PCR扩增鉴定。(6)病毒滴度的测定,将pT67?GDNF细胞培养上清液收集,加入小鼠成纤维细胞培养液,并筛选抗性克隆。(7)大鼠胚胎神经干细胞的体外培养,取怀孕SD大鼠大脑皮质组织经Trypsin消化后,用DMEM?F12培养液培养传代。(8)病毒感染胚胎神经干细胞及免疫组化鉴定,将pT67?GDNF细胞上清液感染NSCs,并筛选得阳性克隆。 ...
【技术特征摘要】
1.胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建,其特征是:它按如下步序进行: (1)质粒转化大肠杆菌,将质粒pSK/GDNF和逆转录病毒表达载体PLNCX2分别加入感受态大肠杆菌,并抽提与纯化质粒DNA。(2)限制性内切酶消化,用限制性内切酶分别消化质粒pSK/GDNF或pLNCX2,并回收DNA。(3)目的基因与载体的连接、转化和克隆鉴定,将目的GDNF和载体pLNCX2大片段DNA在连接酶的作用下连接、转化大肠杆菌,并进行克隆鉴定。(4)重组逆转录病毒的包装,将质粒PLNCX2-GDNF转染包装细胞pT67,并筛选阳性克隆(暂时命名为pT67-GDNF)。(5)PCR鉴定重组逆转录病毒的包装,阳性克隆pT67-GDNF细胞基因组DNA进行PCR扩增鉴定。(6)病毒滴度的测定,将PT67-GDNF细胞培养上清液收集,加入小鼠成纤维细胞培养液,并师选抗性克隆。(7)大鼠胚胎神经干细胞的体外培养,取怀孕SD大鼠大脑皮质组织经Trypsin消化后,用DMEM-F12培养液培养传代。(8)病毒感染胚胎神经干细胞及免疫组化鉴定,将PT67-GDNF细胞上清液感染NSCs,并筛选得阳性克隆。转基因神经球以免疫组化染色鉴定。(9)Western印迹鉴 定⑶NF-NSCs,抽取待鉴定的转基因胚胎神经干细胞⑶NF-NSCs蛋白,行Western印迹并免疫组化鉴定。 (10)ELISA测定⑶NF-NSCs的⑶NF含量,将⑶NF-NSCs细胞上清液收集,以ELISA法测定⑶NF的含量。(11)转基因干细胞⑶NF-NSCs生物活性检测,取大鼠中脑多巴胺组织细胞培养后,加入NSCs-GDNF细胞培养上清液检测⑶NF的生物活性。2.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建,其特征是:所述步序(I)质粒转化大肠杆菌,将TGl大肠杆菌接种于LB液体培养基,以制备感受态大肠杆菌。同时将含GDNF的质粒pSK/GDNF和质粒pLNCX2分别加入到感受态细胞悬液中,转至LB平板培养并挑取阳性菌落进行质粒的抽提与纯化。3.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建,其特征是:所述步序(2)限制性内切酶消化质粒,使用HindIII和NotI分别消化纯化的pSK/⑶NF质粒和pLNCX2质粒,琼脂糖凝胶电泳法进行DNA回收。4.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建,其特征是:所述步序(3)目的基因与载体的连接、转化及克隆鉴定,经过酶切且胶回收的目的⑶NF和载体pLNCX2大片段DNA在T4 DNA Iigase连接酶的作用下,经16°C反应14小时后,转化大肠杆菌。阳性克隆用Hind III和Not I酶切纯化的质粒,命名为pLNCX2-GDNF质粒。其鉴定采用⑶NF基因全长序列的测定法,使用的一对引物上游:5’ -TGG GAT GTCGTGGCT GTC TG-3,:下游:5,-CCG CCG CTT GTT TAT CTG GT-3,。5.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建,其特征是:所述步序⑷重组逆转录病毒的包装,成纤维细胞PT67细胞培养用DMEM完全培养基并加15%的胎牛血清(FBS)培养,细胞汇合度达80 %时用Lipofectamine 2000 (脂染明)将质粒pLNCX2_GDNF转染包装细胞pT67,G418筛选阳性克隆并定名为PT67-GDNF。6.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建,其特征是:所述步序(5) 0 鉴定重组逆转录病毒的包装,?了...
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