一种全人源抗huTIGIT单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及抗人TIGIT单抗。本发明专利技术特别与高亲和力、具有阻断活性的抗人TIGIT单抗有关。本发明专利技术构建了大容量的全合成人源噬菌体抗体库，从中筛选获得了特异性抗人TIGIT单抗，和分子进化后优选的高亲和力抗人TIGIT单抗，包含全人源框架区以及全人源轻链和重链的可变区。

A Human Monoclonal Antibody Against HuTIGIT and Its Application

The present invention relates to anti-human TIGIT monoclonal antibodies. The invention is particularly related to a high affinity and blocking activity anti-TIGIT monoclonal antibody. The invention constructs a large-capacity full-synthetic human phage antibody library, from which a specific anti-human TIGIT monoclonal antibody and a highly affinity anti-human TIGIT monoclonal antibody optimized after molecular evolution are screened and obtained, including the whole-human frame region and the variable regions of the whole-human light chain and heavy chain.

【技术实现步骤摘要】
一种全人源抗huTIGIT单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及基因工程产品，即公开了几株具有高亲和力和阻断活性的全人源抗huTIGIT特异性单克隆抗体。本专利技术构建了大容量的全合成人源噬菌体抗体库，从中筛选并优化获得了4株优选的全人源抗人TIGIT抗体TBB8、TDC8、3TB3和5TB10。本专利技术的优选抗体D1Y1A有较高的亲和力和阻断活性，能够有效地识别人TIGIT抗原。
技术介绍
近年来，治疗性抗体显示出越来越广阔的应用前景。但由于人抗鼠抗体(humananti-mouseantibody,HAMA)的产生使其应用受到很大限制。抗体库技术的出现为这一问题的解决提供了一条新的途径，为各种不同免疫原包括自身抗原的抗体获得提供了一条有效途径。抗体库技术是20世纪90年代抗体工程领域的重大进展，它的出现得益于三大技术的发展，即PCR扩增技术、大肠杆菌表达系统的优化及噬菌体展示技术，尤其是噬菌体展示技术是实现抗体库技术的重要前提。噬菌体展示蛋白质工程或分子进化是蛋白质工程中的一个富有潜力的崭新领域，该技术的显著优点，一是表达的融合蛋白或肽类直接与编码它们的基因相关联，将活的噬菌体繁殖扩增即可鉴定和分析结合肽或蛋白的序列，其二，噬菌体展示肽或蛋白的结构和功能常常与天然肽或蛋白具有一样或极为相似的结构和功能，这一技术已成为基础研究和药物筛选的重要手段。噬菌体抗体库技术避免了传统的从杂交瘤细胞中筛选鼠源单抗，再进行人源化改造的繁琐过程，可在较短时间内，得到完全的人源抗体片段，而且无需经过免疫即可得到大量的针对各种抗原的特异性抗体，使人源性抗体制备技术获得突破性的进展。全合成人源噬菌体抗体库的设计，需要选择具有代表性的骨架序列以及制定覆盖范围广的CDR序列。抗体库技术的发展和对抗体结构功能认识的深化使人们具备了完全人工设计抗体可变区的能力。随着人类抗体胚系(germline)基因测序完成，人们对抗体结构的认识更深入了一步，使得对人抗体基因的操作更加简单易行。对抗体胚系基因使用频率分析表明，胚系基因的使用具有较强的偏向性，许多胚系基因从不或很少使用(Tomlinson,1995)，这一特点是构建抗体库的重要基础。为保证骨架区的代表性和保守性，骨架区的选择和设计通常采用人抗体胚系基因作为基础骨架。选用多个骨架序列构建多骨架库能够更全面地涵盖人抗体库基因。CDR区序列的设计是合成抗体库的关键，这使合成抗体库具有可控性强的优点，可根据需要人为设计改造抗体的基因。合成抗体库的组分清楚，能够在一定程度上改善抗体多样性的可控性，抗体库的内容、位点变异性、库的整体多样性均可根据设计加以控制调节。人为地控制骨架序列和CDR区的设计与合成，可使抗体库的构成和多样性明确化。早期抗体库构建筛选的成功证实了通过全合成技术构建抗体库的可行性，并且为近年来新型合成抗体库的构建积累了丰富的经验。TIGIT(TcellimmunoglobulinandITIMdomain)是近年新发现的一种I型跨膜蛋白，由免疫球蛋白可变区(IgV)、跨膜区和受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitormotif，ITIM)组成，主要表达在调节性T细胞(Treg)、消耗性CD8+T细胞、记忆性T细胞以及自然杀伤细胞(NK)表面(StengelKF,eta1.(2012)ProcNatlAcadSciUSA.109)。TIGIT是一种共抑制性受体蛋白，其和共刺激分子CD226与共同的配体脊髓灰质炎病毒受体PVR/CD155结合。CD226参与增强T细胞活化，而TIGIT参与抑制T细胞应答。CD155表达于未成熟或静止的树突细胞(DCs)，TIGIT与CD155的结合会阻断TIGIT/CD226成熟的信号传递，刺激并增加其分泌IL-10(YuX,eta1.(2009)EurJImmunol.39:3160)。正常情况下，与CD226相比，TIGIT结合到CD155亲和力较强，TIGIT共抑制信号占主导，这意味着激活的免疫抑制是典型的负调节信号。高亲和力的TIGIT/PVR相互作用会产生抑制信号，可阻止对正常表达PVR的(自身)细胞的杀伤，也可通过抑制NK细胞的抗肿瘤反应，保护肿瘤细胞免于免疫细胞介导的杀伤作用(Stanietskyetal.(2009)Proc.Nat'lAcad.Sei.(USA)106:17858；Lozanoeta1.(2012),J.Immunol.188:3869)。有研究发现，TIGIT在肿瘤浸润性Treg细胞上高度富集。肿瘤组织中的TIGIT+Treg细胞表现出高度活性和抑制性的Treg细胞表型。实验表明，CD155在黑色素瘤细胞上(Inozumeetal.(2014)J.Invest,Dermato1.134:S121-Abstract693)和在各种其它肿瘤上过表达。因此，抗TIGIT抗体可增强抗肿瘤免疫反应机制，或者总体上阻断TIGIT/PVR的结合，可用于治疗癌症，例如结肠直肠癌(Hampton.(2015)JMn313:1305),黑色素瘤等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种全人源抗huTIGIT单克隆抗体及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术从构建的大容量全合成人源抗体库中，筛选获得了4株能特异性结合人TIGIT，以及阻断huTIGIT与人PVR/CD155相互作用的全人源抗人TIGIT抗体。本专利技术的申请人进行了大量的实验，采用分子进化的方法，对上述一株单克隆抗体3TB3进行亲和力成熟，结合基因工程技术构建了1株优选的具有高亲和力和阻断活性的抗人TIGIT单克隆抗体，并对其生物学活性进行鉴定。该抗体有较高的亲和力和阻断活性，能够有效地识别人TIGIT抗原。本专利技术的全合成人源抗体库采用以下设计方案。应用生物信息学方法，通过检索Absys、VBASE2、NCBI、Kabat、Genbank、PDB等数据库，下载人源和鼠源等抗体基因序列，比较分析大量序列之间的同一性和差异性，对抗体骨架序列在人类抗体库中的出现频率进行排序，以保证抗体库的代表性和保守性为原则，选择了优化的VH/VL框架序列，确定了构建抗体库的germline基因，即两种人源IgG型抗体轻链可变区master基因，Vκ2和Vκ3，以及两种人源IgG型抗体重链可变区master基因，VH3和VH4。为了便于文库构建，对抗体骨架序列进行模块化设计，在骨架区和CDR区的边界引入稀有的单一酶切位点，便于CDR区与骨架区的灵活拆卸与组装。对于人源抗体可变区的CDR区域，收集抗体可变区的氨基酸序列(包括所有的人抗体胚系基因和重排序列)，进行序列同源性分析和氨基酸使用频率和偏向性分析。选择CDR区域多样性较高的氨基酸位置，按大肠杆菌密码子使用原则将其转换为核苷酸序列，使用简并密码子进行了长度多样性和序列多样性设计，尽量合理地覆盖所有典型的CDR结构。利用成熟的抗体库构建和噬菌体展示技术，筛选特异性结合人TIGIT抗原的分子。本专利技术所使用的抗体库，是大容量的全合成人源scFv噬菌体抗体库。为了提高和改变获得的抗体分子亲和力，采用了亲和力成熟技术，通过分子进化改进TIGIT单抗分子的结合能力。本专利技术的分子进化技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种全人源抗huTIGIT单克隆抗体，包括4株全人源抗TIGIT单抗TBB8，TDC8，3TB3，5TB10，其特征在于，所述全人源抗TIGIT单克隆抗体能特异性地与人TIGIT结合，且能在细胞水平阻断huTIGIT与人PVR/CD155(huCD155)的相互作用。

【技术特征摘要】
1.一种全人源抗huTIGIT单克隆抗体，包括4株全人源抗TIGIT单抗TBB8，TDC8，3TB3，5TB10，其特征在于，所述全人源抗TIGIT单克隆抗体能特异性地与人TIGIT结合，且能在细胞水平阻断huTIGIT与人PVR/CD155(huCD155)的相互作用。2.如权利要求1所述的全人源抗huTIGIT单克隆抗体，其特征在于，其是从大容量的全合成人源噬菌体抗体库中筛选得到。3.如权利要求1所述的全人源抗huTIGIT单克隆抗体，其特征在于，其包括轻链与重链，所述轻链可变区包含如SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:11所示氨基酸或与其具有至少80％序列同一性的同源序列，所述重链可变区包含如SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12所示氨基酸或与其具有至少80％序列同一性的同源序列。4.1株全人源抗huTIGIT单克隆抗体D1Y1A，其特征在于，其能特异性地与huTIGIT结合，且能在细胞水平阻断huTIGIT与huCD155的相互作用。5.如权利要求4所述的全人源抗huTIGIT单克隆抗体D1Y1A，其特征在于，其以3TB3的轻重链可变区为母序列，亲和力成熟后得到。6.如权利要求4所述的全人源抗huTIG...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍文英，刘浩，叶洪涛，周伟，李道远，范清林，宋礼华，
申请(专利权)人：安徽安科生物工程集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34