一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体及其应用，属于免疫学技术领域和食品安全分析技术领域。所述抗单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2018217的杂交瘤细胞株分泌产生，该抗体效价为1:10

A Monoclonal Antibody Against Bovine Skeletal Muscle Troponin I and Its Application

The invention relates to a monoclonal antibody against bovine skeletal muscle troponin I and its application, belonging to the field of immunology technology and food safety analysis technology. The anti-monoclonal antibody is secreted by a hybridoma cell line stored in CCTCC NO:C2018217 with a titer of 1:10.

【技术实现步骤摘要】
一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该抗体在检测牛骨骼肌肌钙蛋白I上的应用，属于免疫学
和食品安全分析

技术介绍
在肉类食品中，由于价格、宗教、健康等原因，许多国家制定法规要求食品标签真实明确地标出肉类来源，禁止掺假行为，以保护消费者的利益，但是市场上混淆肉类品种的现象仍然非常普遍，掺假的方式包括掺兑、混入、抽取、假冒等手段，尤其以牛、羊肉制品的掺杂、掺假的行为最为常见，这些掺假行为极大地损害了消费者的利益。目前，国内外许多实验室都使用分子生物学技术手段检测肉制品中的源性成分，DNA检测方法手段多样，主要为核酸探针杂交、DNA指纹分析、PCR特异扩增、PCR-RFLP等。这些方法具有一定的灵敏度，但同时也存在着成本高、对检测对象要求高、工作量大、不能现场检测等缺点，尤其是对于熟肉制品检测有很大不确定性，因为这很大程度上依赖于熟肉制品的处理过程，生产过程的多样性导致了基因物质的不同降解水平。再者，该方法只能检测动物DNA的可能来源，必须时刻防止交叉污染，乳汁、血液、脂肪都有可能是DNA的来源。因此，需要其他的方法来与他它的检测结果相互印证。免疫学方法具有灵敏度高、特异性好、成本低、操作方便等特点，适于大批量样品筛选，其中酶联免疫吸附法和胶体金试纸条是最常用的方法。然而熟肉制品一般都要经过高温、高压处理，在这个过程中许多蛋白都发生了变性，失去了抗原性和水溶性，这就给免疫学方法的建立带来了困难。要想将免疫学法应用于动物源性成分的检测，必须找到一个特异性的热稳定的蛋白质作为标志物抗原，然后研制出针对此抗原的特异性的单克隆抗体。动物骨骼肌中的肌钙蛋白I(TnI)具有种属专一性，可以作为一种耐热种类标志蛋白，区分不同种属生、熟肉制品的肉种类来源。以牛骨骼肌肌钙蛋白I(skTnI)为目标检测物，能实现牛肉源性成分免疫学检测鉴别技术的建立。因此，抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备对于开展牛肉肉源成分的免疫学检验鉴定工作具有重要的实际意义和社会意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有肉源性检测技术缺陷，提供一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体，所述单克隆抗体对牛骨骼肌肌钙蛋白I有特异性，所述抗单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2018217的杂交瘤细胞株skTnI-3A8产生。进一步的，本专利技术将该单克隆抗体应用于检测牛骨骼肌肌钙蛋白I。本专利技术所述技术问题是由以下技术方案实现的。一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2018217的杂交瘤细胞株产生。该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株skTnI-3A8，于2018年12月20日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。上述抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体能与牛骨骼肌肌钙蛋白I特异性结合，效价为1:106，亚型为IgG1，亲和力常数Ka＝8.1×108L/mol。上述牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体在用于配制检测生鲜肉及其制品中的牛骨骼肌肌钙蛋白I的非诊断目的检测产品中的应用。上述应用，所述非诊断目的检测产品为酶联免疫检测试剂盒或胶体金层析试纸条。进一步的，一种检测牛骨骼肌肌钙蛋白I的酶联免疫试剂盒，该试剂盒中含有所述的抗牛骨骼肌肌钙蛋白I的单克隆抗体。一种检测牛骨骼肌肌钙蛋白I的胶体金层析试纸条，该试纸条中含有所述的抗牛骨骼肌肌钙蛋白I的单克隆抗体。一种制备上述牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体的方法，包括如下步骤：(1)抗原的制备取牛的骨骼肌去除脂肪和结缔组织，研磨混匀，称取40g加入0.15M的NaCL溶液(1:2w/v)；进一步混匀后，超声提取5min(50W，20KHz)，再用沸水加热20min后，2000g离心30min；去除沉淀，取一半上清液过滤后为处理液1。另一半上清液用121℃高压30min，5000g离心30min后，用Whatman1号滤纸过滤，滤液加入90％乙醇(1:3.74v/v)，取混合液7000g离心20min，取沉淀37℃烘干，生理盐水复溶后为处理液2。处理液1和处理液2经SDS-PAGE电泳鉴定后将电泳条带1和条带2研磨，用生理盐水稀释后分别作为检测抗原和免疫抗原。(2)制备牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体：(a)动物免疫：选择提取的免疫抗原，免疫6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，间隔2周免疫1次，3次免疫后断尾取血测定效价和抑制率，选择免疫结果最佳的小鼠准备融合；(b)细胞融合：取步骤(a)选定的小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，间接ELISA法测定上清液选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生单一抗牛骨骼肌肌钙蛋白I的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(c)单克隆抗体的大量制备：选取个体较大的雌性Balb/c小鼠，采用体内诱生腹水法，大量制备腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，分成小管，-20℃保存，获得牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体。一种鉴定上述牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体特性的方法，包括如下步骤：(a)效价测定用pH9.6的碳酸盐缓冲液将检测抗原稀释为5μg/ml包被检测板，将纯化后的单克隆抗体进行1:2000，1:4000，1:8000，……1:1024000稀释，加入到酶标板孔内，反应后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，最后用TMB显色，结果显示，纯化后的牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体浓度为1mg/mL时的效价达1：106。(b)亚型测定采用购自Sigma公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒进行亚型测定，结果显示，牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体亚型为IgG1。(c)亲和力测定采用间接ELISA法测定牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体的亲和常数，结果显示，亲和常数Ka＝8.1×108L/mol。(d)特异性测定用间接ELISA测定单克隆抗体与牛、羊、鸡、鸭、猪的骨骼肌提取物的交叉反应。结果显示牛skTnI-3A8与反刍动物(牛、羊)骨骼肌提取物的效价为1:100万，与鸡、鸭、猪骨骼肌提取物的效价低于1:1万，特异性较好。本专利技术提供的单克隆抗体可应用于检测样品中牛骨骼肌肌钙蛋白I，主要是将其应用于制备牛骨骼肌肌钙蛋白I检测的酶联免疫检测试剂盒和胶体金试条纸。本专利技术提供的抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体的质量具有很强的可控性和可重复性，并通过对所得抗体特性的初步分析及鉴定，为特异、灵敏的免疫测定方法的进一步建立和应用提供了实验依据。附图说明图1本专利技术所述提取牛骨骼肌肌钙蛋白ISDS-PAGE鉴定图，图1a彩色图，图1b黑白图图2本专利技术所述牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体效价测定图图3本专利技术所述牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体亚型测定图图4本专利技术所述牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体特异性测定图本专利技术所述的抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体的杂交瘤细胞株skTnI-3A8，已于2018年12月20日送交中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)保藏，保藏编号CCTCCNO:C2018217。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明，所列举的实施例不对本专利技术的内容和保护范围构成任何限制。下述实施例中所用的材料、试剂等，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2018217的杂交瘤细胞株skTnI‑3A8产生。

【技术特征摘要】
1.一种抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2018217的杂交瘤细胞株skTnI-3A8产生。2.根据权利要求1所述的抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体，其特征在于，该抗体效价为1:106，亚型为IgG1，亲和力常数Ka＝8.1×108L/mol。3.一种产生如权利要求1或2所述的抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体的杂交瘤细胞株skTnI-3A8，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:C2018217，保藏日期为2018年...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春生，李玉静，刘静静，吴萌，张静，李云，张岩，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13