抗人β2-微球蛋白抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及新型的抗人β2‑微球蛋白抗体及其应用，属于免疫化学领域。本发明专利技术制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(BM12及BM17)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人临床样本检测的人β2‑微球蛋白的胶体金快速检测试纸卡的产业化应用。

Antibody against human beta 2-microglobulin and its application

The present invention relates to a novel anti-human beta 2 -microglobulin antibody and its application, belonging to the field of immunochemistry. Various antibodies are prepared and screened pairwise to obtain antibody combinations (BM12 and BM17) with sensitivity and specificity that can meet the needs, at the same time, they are convenient for mass production and can meet the needs of large-scale clinical application in the future. The debugging and optimization of the detection system for the above antibody combinations were carried out. The results showed that the operation was simple, sensitivity, specificity and related detection performance could meet the industrial application of the colloidal gold test paper card for rapid detection of human beta 2 microglobulin in human clinical samples.

【技术实现步骤摘要】
抗人β2-微球蛋白抗体及其应用
本专利技术属于生物
，具体的涉及两种抗人β2-微球蛋白抗体及其制备方法以及上述抗体在人β2-微球蛋白定量检测中的应用。
技术介绍
β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)是一种由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种内源性小分子球蛋白，分子量为11.8kDa；由99个氨基酸组成的单链多肽，在免疫应答中起重要作用；是细胞表面人白细胞抗原的β链部分，分子内含有二硫键，不含糖，与免疫球蛋白的结构相似。β2-MG广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中。血清β2-MG的合成速度和细胞膜释放的量是非常恒定的，从而使β2-MG含量保持稳定水平。正常人β2-MG可以从肾小球自由滤过，99.9％在近端肾小管吸收并在肾小管上皮细胞中分解破坏，因此正常尿液中排出量很微量。在肾小球滤过功能受损或滤过负荷增加的情况下，血液中的β2-MG含量增加；而尿液中排出的β2-MG含量增加，则提示肾小管损害或滤过负荷增加。对于肾移植病人，β2-MG检测则可预示机体是否发生排斥反应。尿β2-MG还有助于鉴别上、下尿路感染。综上所述，β2-MG是一种具有较高临床应用价值的检测指标。测定β2-MG的方法有酶联免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、微粒子酶免疫分析法。酶联免疫吸附分析法重复性差，适合大批量检测。放射免疫分析法和放射比浊法由于核素有半衰期，试剂有效期短；此外核素有放射污染，而且核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员亦须经过特殊训练，不易普及，在测定时还需要昂贵的免疫测定仪；免疫透射比浊法特异性高，方法简单、快速，无放射污染，结果稳定性、重复性满足临床要求。但在抗原、抗体比例不同时，如出现前带或后带现象，对测定结果有较大的影响。此外，在高血脂存在的情况下，脂蛋白的小颗粒可形成浊度，使测定值假性升高，因此测定时尽量不用脂血标本。
技术实现思路
本专利技术采用胶体金法，该法快速、简便，易操作，自动化程度高，且与ELISA法、免疫比浊法等均具有很好的相关性，临床应用非常广泛，与其他方法检测试剂比较，通用性较强，而这其中首要解决的技术问题是提供一组能有效的、特异性结合人β2-MG的抗体。更具体地说：本专利技术的第一目的在于提供两种抗人β2-MG抗体。第一种抗人β2-MG抗体(BM12)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：1所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：2所示的HCDR2和如序列SEQIDNO：3所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：4所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：5所示的LCDR2和如序列SEQIDNO：6所示的LCDR3。优选的是本专利技术中BM12抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。第二种抗人β2-MG抗体(BM17)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：9所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：10所示的HCDR2和如序列SEQIDNO：11所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：12所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：13所示的LCDR2和如序列SEQIDNO：14所示的LCDR3。优选的是本专利技术中BM17抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示。本专利技术第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体BM12的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示；所述抗体BM17的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示。本专利技术第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，所述编码单链抗体BM12的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示、编码单链抗体BM17的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。本专利技术第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。本专利技术第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主菌。本专利技术第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。本专利技术的第七个目的在于提供上述抗人β2-MG抗体在检测人β2-MG含量中的应用。本专利技术的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人β2-MG的抗体对组合；且检测灵敏度高，特异性好。本专利技术的第九个目的在于提供一种利用所述抗人β2-MG抗体检测β2-MG抗体的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体BM17，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有抗体BM12。上述胶体金免疫层析定量检测卡所用封闭液为1％-10％BSA、0.01MPB溶液，pH7.4。所用金标抗体复溶液为1％-10％BSA、5％海藻糖、0.025％tween20、0.01MPB溶液，pH7.4。所用抗体包被液为0.5％-2.5％海藻糖、0.01MPB溶液，pH7.4。所用样本稀释液为0.1％Proclin300、0.01MPBS溶液，pH7.4，还可以含有1％BSA。本专利技术制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的一组抗体组合(BM12及BM17)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人血液或尿液样本检测的人β2-MG的胶体金免疫层析定量检测卡。附图说明图1：抗体BM12及BM17特异性检测效果图(WesternBlot)，其中图1a为抗体BM12WesternBlot图；图1b为抗体BM17WesternBlot。泳道1为标准蛋白质(Marker)；泳道2为人β2-MG。图2：本专利技术胶体金免疫层析定量检测卡结构示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸收垫、4为质控线(C线)、5为检测线(T线)、6为金标垫、7为PVC片材。图3：实施例6β2-MG检测卡(12-17)检测范围拟合曲线图4：实施例6β2-MG检测卡(12-17)线性范围拟合曲线图5：实施例6β2-MG检测卡(12-17)方法学比对相关性具体实施方式定义“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。“单链抗体”(scFv)指的是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将VL的N端连接至VH的C末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。互补决定区(complementarity-determiningregion,CDR)，也叫做高变区。成型于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗人β2‑微球蛋白抗体，包括：重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

【技术特征摘要】
1.抗人β2-微球蛋白抗体，包括：重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：1所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：2所示的HCDR2和如序列SEQIDNO：3所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：4所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：5所示的LCDR2和如序列SEQIDNO：6所示的LCDR3。2.权利要求1所述的抗人β2-微球蛋白抗体，其特征是重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，轻链可变区的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，赵利利，王安良，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32