抗人肌红蛋白抗体及其在检测试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术涉及新型的抗人肌红蛋白抗体及其在检测试剂盒中的应用，属于免疫化学领域。本发明专利技术制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(M26及M08)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，可完全满足制备人肌红蛋白的荧光快速检测试纸卡的应用需求，所述荧光快速检测试纸卡操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能均符合商业化应用指标。

Anti-human myoglobin antibody and its application in detection kit

The invention relates to a novel anti-myoglobin antibody and its application in a detection kit, belonging to the field of immunochemistry. The invention has prepared a variety of antibodies and screened them pairwise to obtain antibody combinations (M26 and M08) with sensitivity and specificity that can meet the needs, and is convenient for mass production and can meet the needs of large-scale clinical application in the future. The debugging and optimization of the detection system for the above antibody combinations can fully meet the application requirements of the fluorescence rapid detection test paper card for preparing human myoglobin. The fluorescence fast detection test paper card has the advantages of simple operation, sensitivity, specificity and related detection performance, which are in line with the commercial application indicators.

【技术实现步骤摘要】
抗人肌红蛋白抗体及其在检测试剂盒中的应用
本专利技术属于生物
，具体的涉及两种抗人肌红蛋白(MYO)抗体及其制备方法以及上述抗体在人肌红蛋白检测中的应用。
技术介绍
肌红蛋白(MYO)是骨骼肌和心肌特异性氧结合蛋白。分子量为16.7KDa，由一条含有153个氨基酸残基的多肽链和一个血红素辅基构成，呈紧密球形。由于肌红蛋白分子量小，当肌细胞受损时，肌红蛋白会释放至循环系统中，1～2小时升高，12小时达到峰值，24小时后逐渐下降，是早期诊断急性心肌梗塞等疾病的重要参考指标。目前肌红蛋白的免疫检测方法主要有胶体金免疫层析法、酶联免疫测定法和化学发光免疫测定法等。胶体金免疫层析法具备操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需要特殊设备等优点，但由于灵敏度不高，难以实现定量等缺点限制了这种方法的使用。酶联免疫测定法由于具备操作简单，试剂有效期长，无污染、高于胶体金的敏感性、特异性好、结果可用仪器测定等特点，但由于敏感性相对较低，所用标记酶与底物可定量测定范围窄及仪器测定范围窄等缺点，限制了其在微量免疫定量测定中的应用。化学发光免疫分析法虽具有准确、灵敏度高、特异性强、精密度好的优点，但其所用仪器价格昂贵，所用试剂又为进口试剂，一般实验室难以开展，并且不适用于急诊检验。因此，建立一种检测时间尽量短，并且除了能在实验室进行检测外，还能够进行床旁检测，同时能定量测定MYO的检测方法，从而为临床提供准确的诊断依据，是十分必要的。为克服现有肌红蛋白(MYO)检测技术的不足，本专利技术提供了一种快速检测MYO的荧光定量试纸条及其制备方法与应用。本专利技术根据免疫荧光技术特点和MYO抗原抗体系统特点，设计新的原材料、试剂和工艺流程，应用本专利技术提供的试纸条检测MYO水平，具有简单、快速、灵敏和特异性好等特点,因此适用于检测精密度要求较高的检验中心或大型医院临床科室的应用需求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供能有效的、特异性结合人肌红蛋白的抗体。更具体地说：本专利技术的第一目的在于提供两种抗人肌红蛋白抗体。第一种抗人肌红蛋白抗体(M26)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：1所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：2所示的HCDR2和如序列SEQIDNO：3所示的HCDR3；其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：4所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：5所示的LCDR2和如序列SEQIDNO：6所示的LCDR3。优选的是上述抗体(M26)的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。第二种抗人肌红蛋白抗体(M08)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：9所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：10所示的HCDR2和如序列SEQIDNO：11所示的HCDR3；其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：12所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：13所示的LCDR2和如序列SEQIDNO：14所示的LCDR3。优选的上述抗体(M08)的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示。本专利技术第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体(M26)的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示；所述单链抗体(M08)的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示。本专利技术第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，编码单链抗体(M26)的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示，和编码单链抗体(M08)的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。本专利技术第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。本专利技术第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞。所属宿主细胞可以是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，优选为大肠杆菌。本专利技术第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。本专利技术的第七个目的在于提供上述抗人肌红蛋白抗体在检测人肌红蛋白含量中的应用。本专利技术的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人肌红蛋白的抗体对组合M26和M08；该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。本专利技术的第九个目的在于提供一种利用所述抗人肌红蛋白抗体检测人肌红蛋白的荧光定量检测试纸卡，包括样品垫、反应膜、吸水垫、荧光结合垫；所述荧光结合垫喷涂有荧光微球标记的抗体M08，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有抗体M26。作为优选上述试纸卡所用封闭液为：1％-10％BSA、50mMpH8.0的硼酸缓冲液。作为优选上述试纸卡所用荧光抗体稀释液为：0-10％BSA、0-10％海藻糖、0-0.025％吐温20、50mMpH8.0的硼酸缓冲液。作为优选上述试纸卡所用包被抗体稀释液为：0-3％甲醇、0-0.025％吐温-20、0.05mMpH7.2的PBS。作为优选上述试纸卡所用样本稀释液为：0-0.5％BSA、0.05％安替比林、0-0.025％吐温-20、0.05％proclin300、0.05mMpH7.2-8.0的硼酸缓冲液。本专利技术制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(M26及M08)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能均可满足人临床样本检测的荧光定量检测试纸卡。附图说明图1.抗体M08及M26特异性检测效果图(WesternBlot)，其中图1a为抗体M08WesternBlot图；图1b为抗体M26WesternBlot图。泳道1为标准蛋白质(Marker)；泳道2为人MYO。图2.荧光定量检测试纸卡结构示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸水垫、4为质控线(C线)、5为检测线(T线)、6为荧光结合垫、7为PVC片材。图3.荧光定量检测试纸卡检测范围拟合曲线。其中横坐标为蛋白浓度(ng/mL)；纵坐标为检测值；R2为0.998。图4.荧光定量检测试纸卡线性范围拟合曲线。其中横坐标为理论浓度(ng/mL)；纵坐标为检测值；R2为0.995。图5.本专利技术的荧光定量检测试纸卡与化学发光法检测结果相关性。其中横坐标为强生化学发光法测定值(ng/mL)；纵坐标为检测值；R2为0.982。具体实施方式定义“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。“单链抗体”(scFv)指的是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将VL的N端连接至VH的C末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。互补决定区(complementarity-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗人肌红蛋白抗体，包括：重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；以及轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

【技术特征摘要】
1.抗人肌红蛋白抗体，包括：重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的HCDR1、如SEQIDNO：2所示的HCDR2和如SEQIDNO：3所示的HCDR3；以及轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如SEQIDNO：4所示的LCDR1、如SEQIDNO：5所示的LCDR2和如SEQIDNO：6所示的LCDR3。2.如权利要求1所述的抗人肌红蛋白抗体，其特征是所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，赵利利，赵百学，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32