一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，属于微生物学领域。该方法包括以下步骤：双元载体pAg1‑H3酶切去除潮霉素抗性基因片段，与含有来源于米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段连接，构建成pAg1‑Pt双元载体；双元载体pAg1‑Pt质粒转化农杆菌，获得农杆菌阳性转化子，制备菌液；制备黄曲霉菌丝均质液；将制备所得菌液与制备所得的菌丝均质液混合后共培养，进行黄曲霉的遗传转化；选择性培养，筛选黄曲霉转化子并鉴定阳性克隆。本发明专利技术以黄曲霉菌丝体作为转化受体，不受黄曲霉菌株产孢能力的限制，转化效率高且稳定，对不同遗传背景和营养缺陷型的黄曲霉菌株均适用。

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法
本专利技术属于微生物学领域，具体涉及一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法。
技术介绍
黄曲霉（Aspergillusflavus）可以寄生于粮食、食品及饲料中进行生长繁殖，并产生黄曲霉毒素，其中以黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）的危害最大，具有强肝脏毒性和致癌效应。目前全球每年有25%农作物被霉菌毒素污染，其中最为严重的就是黄曲霉毒素的污染。我国花生和玉米被黄曲霉污染的情况比较普遍，畜禽饲料和水产饲料的黄曲霉污染则更为严重。因此，预防和控制黄曲霉污染具有重大的意义。目前，研究人员尝试了多种不同的方法来防控黄曲霉及黄曲霉毒素的污染，例如培育抗黄曲霉作物、用不产毒黄曲霉菌株进行种群替换以及运用一些分子生物学手段来控制黄曲霉产毒等。这些方法都依赖于对黄曲霉菌株进行遗传操作和分子生物学研究。而建立高效、稳定的黄曲霉遗传转化体系，则是对黄曲霉进行遗传操作和分子生物学研究的前提和基础。目前，常用的丝状真菌的遗传转化方法包括原生质体转化法、农杆菌转化法、电转化法、基因枪转化法等。在黄曲霉遗传转化的操作中，多采用原生质体转化法，即先使用细胞壁水解酶类处理黄曲霉新鲜菌丝，以产生的原生质体为受体，通过PEG-CaCl2介导使外源DNA与原生质体融合转化。该方法的缺点是原生质体的制备过程繁琐，耗时长，所需的水解酶费用高昂，且制备的原生质体较脆弱，容易死亡，再生培养难度大，融合诱导剂PEG对原生质体具有一定的毒性，其后期得到的转化子数量有限。虽然也曾有报道用农杆菌转化法对黄曲霉进行遗传操作，但他们是以孢子作为农杆菌侵染的受体进行转化（LiuW,SunY,ChenWetal.,Antimicrob.AgentsChemother.,2012,56(5):2598-2603;HanG,ShaoQ,LiCetal.,J.Microbiol.2018,56(5):356-364）。这种农杆菌介导的黄曲霉转化法依赖于无性分生孢子的产生，对于不产孢的黄曲霉菌株，特别是生物学研究过程中构建的基因突变菌株，以孢子作为受体的农杆菌转化就无法施行，也就无法对这些菌株继续进行遗传操作和深入研究。另外，在对黄曲霉进行生物学研究时，往往需要几种不同的遗传转化筛选标记。由于不同黄曲霉菌株的遗传背景和营养缺陷存在差异，有限的几种筛选标记常常不能充分满足科学研究的需求。吡啶硫胺抗性基因ptrA来源于米曲霉，以往是在黄曲霉的原生质体转化中应用，不受菌株遗传背景和营养缺陷的限制，是个有效的抗性筛选标记，但还未在农杆菌介导的黄曲霉转化中应用过。因此，黄曲霉还缺少一套简单高效、费用低廉且不受菌株产孢能力、遗传背景和营养缺陷类型限制的农杆菌遗传转化系统。构建一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝体为受体的遗传转化方法，对于推动黄曲霉功能基因组学及分子生物学等研究具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种新的农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，以解决黄曲霉遗传转化通常需要制备原生质体，且步骤繁琐、费用高昂的问题，同时能够解决不产孢黄曲霉菌株的遗传转化问题。本专利技术的另一目的在于提供一种吡啶硫胺抗性基因ptrA在农杆菌介导的黄曲霉遗传转化中的应用，以吡啶硫胺抗性基因ptrA作为黄曲霉抗性筛选标记，从而解决不同遗传背景、营养缺陷型的黄曲霉菌株进行农杆菌介导的遗传转化时筛选标记受限的问题。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，该转化方法以携带双元载体的农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）侵染黄曲霉（Aspergillusflavus）的菌丝。一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，该转化方法农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）侵染受体为黄曲霉（Aspergillusflavus）的菌丝。作为优选，所述的农杆菌采用农杆菌菌株AGL-1、GV3101、LBA4404、EHA105；最优选，农杆菌为农杆菌菌株AGL-1。作为优选，所述农杆菌的双元载体以pAg1-H3载体（ZhangA,LuP,Dahl-RoshakAMetal.,Mol.Genet.Genomics,2003,268(5):645-655）酶切去除潮霉素抗性基因片段后的部分为骨架，再与含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因（Pyrithiamineresistantgene）ptrA作为黄曲霉遗传转化筛选标记的目的片段连接，构建pAg1-Pt表达载体进行农杆菌介导的黄曲霉的遗传转化。该载体也能广泛应用于其他对吡啶硫胺敏感的丝状真菌的遗传操作和生物学研究。上述的一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，该方法包括以下步骤：（1）先将双元载体pAg1-H3酶切去除潮霉素抗性基因片段，再与含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段连接，构建成pAg1-Pt双元载体；（2）将双元载体pAg1-Pt质粒转化农杆菌，获得农杆菌阳性转化子，制备阳性转化子农杆菌菌液；（3）制备黄曲霉菌丝均质液；（4）将步骤（2）制备所得阳性转化子农杆菌菌液与步骤（3）制备所得黄曲霉菌丝均质液混合后共培养，进行黄曲霉的遗传转化；（5）选择性培养，筛选黄曲霉转化子并鉴定阳性克隆。作为优选，上述的步骤（1）包括以下具体步骤：（a）将双元载体pAg1-H3用酶切去除潮霉素抗性基因片段，回收pAg1载体片段；（b）将步骤（a）回收的pAg1载体片段与含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段连接，构建pAg1-Pt双元载体。进一步的，步骤（b）所述含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段，从米曲霉基因组DNA上通过PCR方法扩增得到，或以含有来源于米曲霉ptrA基因的各种载体质粒为模板通过PCR扩增得到，或从含有来源于米曲霉ptrA基因的各种载体质粒上通过酶切回收得到；更进一步的，所述含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段，除了具有筛选标记基因ptrA元件外，还包括启动子（PgpdA、PtrpC、PglaA、PalcA、PalcC、PamdS、PtpiA、PexlA、PglaA、PgdhA、PamyA、PamyB、PaphA、PsucA、PadhA、PpkiA、PsodM、PpgkA、PhlyA和PenoA等）、报告基因（mcherry、rfp、Dsred、gfp、egfp、sgfp、yfp、eyfp、cfp、ecfp、bfp、ebfp、cat、gal、gus、lux、luc、Rluc和seap等）和终止子（TtrpC、TgpdA、TsumO、TCYC1和TcgrA等）中的任意一个或多个其他核苷酸序列。该pAg1-Pt双元载体也能广泛应用于其他对吡啶硫胺敏感的丝状真菌的遗传操作和生物学研究。作为优选，上述的步骤（2）包括以下具体步骤：（a）步骤（1）构建的双元载体pAg1-Pt质粒转化农杆菌；（b）筛选鉴定获得农杆菌阳性转化子；（c）挑取农杆菌阳性转化子，接种到含有利福平和卡那霉素的LB液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养20~48h，离心，收集菌体；（d）用含有利福平、卡那霉素和乙酰丁香酮的IM培养基重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，其特征在于，以黄曲霉的菌丝作为农杆菌侵染的受体来进行黄曲霉的遗传转化；以来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA作为黄曲霉遗传转化的筛选标记。

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，其特征在于，以黄曲霉的菌丝作为农杆菌侵染的受体来进行黄曲霉的遗传转化；以来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA作为黄曲霉遗传转化的筛选标记。2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）先将双元载体pAg1-H3酶切去除潮霉素抗性基因片段，再与含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段连接，构建成pAg1-Pt双元载体；（2）将双元载体pAg1-Pt质粒转化农杆菌，获得农杆菌阳性转化子，制备阳性转化子农杆菌菌液；（3）制备黄曲霉菌丝均质液；（4）将步骤（2）制备所得阳性转化子农杆菌菌液与步骤（3）制备所得黄曲霉菌丝均质液混合后共培养，进行黄曲霉的遗传转化；（5）选择性培养，筛选黄曲霉转化子并鉴定阳性克隆。3.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤（1）包括以下具体步骤：（a）将双元载体pAg1-H3用酶切去除潮霉素抗性基因片段，回收pAg1载体片段；（b）将步骤（a）回收的pAg1载体片段与含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段连接，构建pAg1-Pt双元载体；所述含有来自米曲霉的吡啶硫胺抗性基因ptrA的目的片段，除了具有筛选标记ptrA外，还包括启动子、报告基因、终止子中的任意一个或多个其他核苷酸序列。4.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤（2）包括以下具体步骤：（a）双元载体pAg1-Pt质粒转化农杆菌；（b）筛选鉴定获得农杆菌阳性转化子；（c）挑取农杆菌阳性转化子，接种到含有利福平和卡那霉素抗生素的LB液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养20~48h，离心，收集菌体；（d）用含有利福平、卡那霉素和乙酰丁香酮的IM培养基重悬菌体，将菌体浓度稀释至OD600=0.1~0.2，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.6~0.8，即得阳性转化子农杆菌菌液。5.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的以黄曲霉菌丝为受体的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤（3）包括以下具体步骤：（a）将黄曲霉菌丝或孢子接种于PDA培养基，37℃避光培养1~3d；（b）洗脱PDA培养基表面的气生菌丝接种到YGT或...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂鑫怡，张轶，王银春，李博文，王秀娜，汪世华，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35