【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种快速培育转基因甘蔗的方法，尤其涉及一种利用甘蔗种茎快速获得转基因甘蔗的方法。
技术介绍
1、甘蔗(saccharumspp.)是一年生或多年生热带和亚热带的c4作物，属禾本科甘蔗属。作为我国最主要的糖料作物，关系着我国的食糖安全，同时由于其高生物量、高纤维及多年宿根的特性，又使其成为了最重要的能源作物，在美国和巴西，有近90％的生物燃料乙醇是用甘蔗生产的。然而，在甘蔗生产过程中，易遭受干旱、低温及各种病虫害的胁迫，造成巨大的经济损失，严重制约其生产。培育抗性品种是最经济且受环境影响最小的应对措施。由于现代甘蔗杂交种染色体多达120条，甘蔗遗传背景复杂，传统的杂交育种培育出一个新品种长达数年之久，而且单纯依赖杂交技术培育具有高产、高糖、抗逆性强的聚合基因型品种极其困难。随着科技的发展，基因工程技术可定向改良作物品种的某一特定性状，尤其是抗逆性，因此，通过转基因技术定向改良甘蔗品种的某一特定性状，可以大大缩短甘蔗良种的育成周期，加快品种改良的进度。
2、同时，转基因技术是反向遗传学的关键技术，获得转基因植物是抗逆关键基因功能验证与分子机制研究的前提。但是一直以来，甘蔗遗传转化效率低，时间久，成了科研人员深入开展甘蔗功能基因研究的“瓶颈”问题。
3、针对以上问题，我们直接利用甘蔗种茎，在超声波的作用下，通过农杆菌介导法进行甘蔗遗传转化，快速高效地获得转基因甘蔗，为甘蔗品种的定向改良以及基因功能研究的深入开展提供技术支撑。
技术实现思路
2、本专利技术的目的是通过以下方法实现的：
3、本专利技术的一种快速获得转基因甘蔗的方法，包括农杆菌侵染菌液的制备、甘蔗侵染受体材料的准备、农杆菌介导遗传转化、抗性筛选培养、转基因材料鉴定，具体如下：
4、(1)农杆菌侵染菌液的制备：
5、(a)从-80℃冰箱中取出含有pgreenii0229质粒(pgreenii0229质粒含有bar基因)的eha105农杆菌菌株，在含卡那霉素(50mg/l)和利福平(40mg/l)的lb培养基平板上划线，28℃培养过夜，挑取单菌落接种到含有卡那霉素(50mg/l)和利福平(40mg/l)的lb液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至对数生长期；
6、(b)取1ml处于对数生长期的菌液，放入200ml含卡那霉素(50mg/l)和利福平(40mg/l)的lb液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至od600值为1.0-1.5；
7、(c)将菌液转移到离心管中，4℃，5000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；
8、(d)将菌体重悬于等体积含200μmol/l乙酰丁香酮(as)的lb液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养1小时，得到农杆菌侵染菌液；
9、(2)受体材料的制备：
10、(a)选取田间生长健康的伸长期甘蔗种茎，清洗干净，斩断为蔗芽两端各留5cm长的蔗茎；
11、(b)将蔗茎材料清洗干净放入托盘中，使用湿润纱布覆盖，放入培养箱中，30℃，暗处理1-4天，使蔗芽萌动；
12、(c)使用手术刀和眼科镊子，尽可能多地将蔗茎上萌动的蔗芽外层鳞片剥除，但不要破坏生长点，然后用一个无菌针头(0.3mm)，对每个蔗芽随机刺3-5次，得到受体材料；
13、(3)农杆菌介导侵染：
14、(a)将受体材料快速转入农杆菌侵染菌液中，超声处理5min；
15、(b)将超声处理后的受体材料转移到含有农杆菌侵染菌液的玻璃容器中，然后放入真空干燥器中，使用真空泵抽真空至300mmhg压力，进行真空渗透4-6分钟；
16、(c)真空渗透后，取出玻璃容器后，使受体材料继续浸没于农杆菌侵染液中，28℃、20rpm培养8h，然后取出受体材料，在无菌滤纸上控干农杆菌侵染液；
17、(d)将被侵染的受体材料置于暗室中培养24h，温度24±2℃，保持空气湿度50％-60％；
18、(4)受体材料抗性筛选：
19、(a)将暗室中培养后的受体材料放在无菌玻璃容器中，用含有500mg/l特美汀的无菌水清洗甘蔗材料2-3次；
20、(b)将清洗后的受体材料转移到玻璃培养瓶中，使蔗芽向上，然后加入含有500mg/l特美汀和5-10mg/l basta的无菌水，将蔗茎的1/2-2/3浸泡在水中，在28±2℃条件下，光暗交替(14h/10h)培养，每三天更换一次新鲜的无菌水(含有相同浓度的特美汀和basta)，以避免细菌生长；
21、(c)培养20-30天后，用修剪刀小心地将抗性植株剥离种茎，移栽到塑料花盆中(草木灰：沙子：耕作土＝1:1:1)。用含有5-10mg/l basta的蒸馏水灌溉，正常盆栽管理，待长出分蘖苗后，将其彼此分离，并移栽至塑料花盆中，让分蘖苗生长以供进一步选择。
22、(5)抗性材料检测：待移栽的分蘖苗成活后，使用2.0mg/l的basta溶液喷洒幼苗，成活植株即为具有basta抗性的阳性植株，其他植株叶片逐渐枯萎直至最后死亡，取成活植株的叶片使用bar基因检测试纸条进行检测，阳性率达到70％-85％，说明外源bar基因已经成功导入到受体甘蔗中。
23、利用本专利技术的一种利用甘蔗种茎快速获得转基因甘蔗的方法进行甘蔗遗传转化，可以在较短的时间内快速高效地获得转基因甘蔗，为甘蔗品种的定向改良以及基因功能研究的深入开展提供技术支撑。
24、本专利技术的显著优点在于：
25、1.本专利技术获得转基因甘蔗的方法可在2-3个月内得到转基因阳性植株，较常规甘蔗转基因方法所需培育时间缩短50％以上。
26、2.本专利技术培育转基因甘蔗过程中所需仪器设备简单，在一般实验室即可开展。
27、3.本专利技术培育转基因甘蔗过程中免去了大量的组织培养工作，工作量减少80％以上。
28、4.本专利技术的技术方法为甘蔗基因功能研究的深入开展提供了技术支撑。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种利用甘蔗种茎快速获得转基因甘蔗的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法在甘蔗育种中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种利用甘蔗种茎快速获得转基因甘蔗的方法，其特征在于：包括以下...
【专利技术属性】
技术研发人员：许莉萍，杨颖颖，高世武，郭晋隆，阙友雄，苏亚春，罗俊，吴期滨，李大妹，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：
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