pSP107质粒及其应用、构建方法技术

pSP107质粒及其应用、构建方法，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种新的质粒pSP107质粒、以及该pSP107质粒的应用和构建方法。本发明专利技术的质粒可以转化到UET2和UEMT2原生质体中，获得UeTSP菌株和UeMTSP菌株，这两种菌株可以侵染茭白使茭白孕茭，为人工孕茭提供了一种新的思路。

【技术实现步骤摘要】
pSP107质粒及其应用、构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及pSP107质粒及其应用、构建方法。
技术介绍
菰黑粉菌（Ustilagoesculenta）是一种独特的病原真菌，其侵染茭白植株（Zizanialatifolia）后可抑制植株抽穗开花并刺激茎基部膨大形成可食用的茭白。在东亚及东南亚地区尤其是中国，茭白是一种营养很高的水生蔬菜，也是一种重要的药材。但是田间常出现充满冬孢子的灰茭和少量冬孢子形成的芝麻茭，误食后易形成肺炎，不利于茭白产业的发展。鉴于人工育种技术的成功开发，如何控制茭白中菰黑粉菌冬孢子的形成将是茭白人工育种的一大关键。前期研究发现，菰黑粉菌与其他二型态真菌类似，存在酵母型和菌丝型两种型态，而由酵母型向菌丝型转换是此类真菌致病性的关键。在菰黑粉菌中，其二型态转换受到a，b基因的调控，需要两个性亲和单倍体融合形成双核菌丝，在侵染过程中受环境因子影响菌丝内两个细胞核核融形成一个二倍体的核从而产生二倍体的冬孢子。申请人在长期研究过程中发现自龙茭2号灰茭中分离得到单倍体菌株UET1（交配基因型为a1b1，该菌株在CN105838616A的专利技术专利中已经公开，保藏号为CGMCCNo.11843）、UET2（交配基因型为：a2b2，该菌株在CN105838615A的专利技术专利中已经公开，保藏号为：CGMCCNo.11844）、UEMT3（交配基因型为a3b3，该菌株在CN105838617A的专利技术专利中已经公开，保藏号为：CGMCCNo.11842）和UEMT2（交配基因型为a2b2，该菌株在CN105838618A的专利技术专利中已经公开，保藏号为：CGMCCNo.11841）。当UET1与UET2或当UEMT3与UEMT2两个性亲和菰黑粉菌共培养时，两个性亲和菰黑粉菌共培养时，体外培养的菌落从酵母型向菌丝型转变，菌落生长气生菌丝，菌丝可以侵染茭白，使茭白孕茭，但是容易产生灰茭。基于上述问题，申请人成功构建pSP107质粒，经试验发现该质粒经原生质体转化，可获得单倍体的可产生菌丝的UeTSP菌株和UeMTSP菌株，该菌株可成功侵染茭白。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种pSP107质粒及其应用、构建方法的技术方案。所述的一种带有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的pSP107质粒。所述的pSP107质粒作为菰黑粉菌UET2或UEMT2的原核表达载体的应用。所述的pSP107质粒作为菰黑粉菌UET2或UEMT2的原核表达载体获得UeTSP和UeMTSP菌株的应用，所述的UeTSP和UeMTSP菌株能够侵染茭白使茭白孕茭。所述的pSP107质粒的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）获得菰黑粉菌UET1菌株基因组DNA；2）以菰黑粉菌UET1菌株基因组DNA为模板，以mfa1.2F和mfa1.2R，bE1F和bE1R为引物进行PCR,获得mfa1.2和bE1基因序列，所述的mfa1.2F的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，mfa1.2R的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，bE1F的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，bE1R的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；3）用mfa1.2F和bE1R引物，以mfa1.2和bE1基因序列为模板，进行融合PCR，将mfa1.2和bE1基因连接成一个长片段；4）将融合PCR产物和pUMa932质粒经限制性内切酶ECORⅤ和HindⅢ双酶切2h后的产物，连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆培养后提取重组质粒，即为原核表达质粒pSP107。本专利技术的质粒经酶切后，可以转化到UET2和UEMT2原生质体中，获得UeTSP菌株和UeMTSP菌株，这两种菌株可以侵染茭白使茭白孕茭，为人工孕茭提供了一种新的思路。附图说明图1为mfa1.2和bE1基因电泳扩增图；图2为pUMa932质粒图谱；图3为pUMa932质粒经双酶切图；图4为mfa1.2和bE1基因融合PCR结果图；图5为pSP107质粒图谱；图6为构建的UeTSP菌株在YEPS平板上活化，观察12、24、36、48小时的菌（下）及菌落（上）形态显微观察图；图7为构建的UeMTSP菌株在YEPS平板上活化，观察12、24、36、48小时的菌（上）及菌落（下）形态显微观察图；图8为茭白经UeTSP菌株侵染后共聚焦观察图（左图叶鞘，右图茎部）；图9为茭白经UeMTSP菌株侵染后共聚焦观察图（左图叶鞘，右图茎部）。具体实施方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实例1：菰黑粉菌UET1菌株中基因组DNA的提取1、提前半小时在65℃水浴锅内水浴加热CTAB提取液；2、用枪头取UET14菌体（厚度约5mm）于2.0mL离心管中，加入10颗左右不锈钢钢珠（直径1mm），标记；通风橱内，加入800ul预热的CTAB提取液；震荡仪70Hz，震荡150s，破碎菌体；3、65℃水浴1h；4、加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），混匀；5、通风橱内，室温静置15min；室温，10000rpm离心10min；此时离心管内出现分层现象，上清中含有核酸，中间是蛋白层，底部为钢珠和杂质；小心吸取上清液至新的1.5mL离心管中（可一直重复4、5步，直至肉眼不可见中间蛋白层）；8、向上清中加入等体积的异丙醇，温和地颠倒混匀，可直接离心或静置5-10min后离心；9、预冷离心机至4℃，然后4℃，10000rpm离心10min；10、倒上清，加1mL的75%乙醇，轻轻颠倒洗涤DNA；4℃，10000rpm离心5min，弃上清；11、弃去上清后，可置于37℃烘箱中或倒扣在纸巾上5-10min进行干燥，亦可采用其他干燥方式；若底部有残留乙醇也无碍；12、加入30ul无菌水溶解DNA，50℃水浴20min，去除挥发物；-20℃保存。实例2：mfa1.2基因的克隆以实例1中获得的UET1菌株中基因组DNA为模板，根据设计的mfa1.2F和mfa1.2R引物，克隆mfa1.2基因。mfa1.2F的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，mfa1.2R的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。PCR扩增体系：（50ul）10×PCRbuffer（takara）5uldNTPmix（takara）4ulmfa1.2F1ulmfa1.2R1ulLATaq（takara）0.5ulddH2O37.5ulUET1UET1DNA1ulPCR反应条件如下：1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶后用Magen凝胶DNA微量回收试剂盒回收产物。置于﹣20℃冰箱备用。实例3：bE1基因的克隆以实例1中获得的UET1菌株中基因组DNA为模板，根据设计的bE1F和bE1R引物进行PCR，克隆bE1基因。bE1F的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，bE1R的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。PCR扩增体系：（50ul）10×PCRbuffer（takara）5uldNTPmix（takara）4ulbE1F1ulbE1R1ulLATaq（takara）0.5ulddH2O37.5ulUET1UET1DNA1ulPCR反应条件如下：1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶后用Magen凝胶DNA微量回收试剂盒回收产物。置本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种带有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的pSP107质粒。

【技术特征摘要】
1.一种带有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的pSP107质粒。2.如权利要求1所述的pSP107质粒作为菰黑粉菌UET2或UEMT2的表达载体的应用。3.如权利要求1所述的pSP107质粒在菰黑粉菌UET2或UEMT2中表达获得UeTSP和UeMTSP菌株的应用，所述的UeTSP和UeMTSP菌株能够侵染茭白使茭白孕茭。4.如权利要求1所述的pSP107质粒的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）获得菰黑粉菌UET1菌株基因组DNA；2）以菰黑粉菌UET1菌株基因组DNA为模板，以mfa1.2F和mfa1.2R，bE1F和bE1R为引物进行PCR,获得m...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雅芬，叶子弘，于金梦，夏文强，俞晓平，崔海峰，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33