本发明专利技术公开了一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法，属于基因工程技术领域，其是在糖多孢红霉菌中，通过基因工程途径缺失SACE_5754，并过表达其靶基因SACE_0388和SACE_6149，获得红霉素高产工程菌株，用所获得的菌株发酵生产红霉素可以大幅度提高产量，为工业生产提高红霉素产量提供新的技术支持。
A Method of Increasing Erythromycin Yield by SACE_5754 Gene Pathway of Erythromycin Sugar Polyspora
The invention discloses a method for improving erythromycin production by genetic engineering approach of erythromycin SACE_5754, belonging to the field of genetic engineering technology. In erythromycin SACE_5754 is deleted by genetic engineering approach and its target genes SACE_0388 and SACE_6149 are overexpressed to obtain engineering strains with high erythromycin production, which can be fermented by the obtained strains to produce erythromycin substantially. It will provide new technical support for industrial production to increase erythromycin production.
【技术实现步骤摘要】
一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法。
技术介绍
红霉素是糖多孢红霉菌次级代谢产生的一类广谱大环内酯类抗生素，具有良好的抗革兰氏阳性菌活性和较低的肠胃道毒副作用。自1952年首次从糖多孢红霉菌(Saccharopolysporaerythraea)中分离获得后，红霉素的使用率一直位于全球抗生素类药物的前列。糖多孢红霉菌次级代谢产物红霉素各组分中广泛应用的是红霉素A，其抑菌活性最高，而以红霉素A为基础改造的阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素和泰利霉素等也都是当今主流的医用抗生素。由此可见，提高红霉素的产量是当下急需解决的一个问题。由于红霉素A的结构较为复杂，采用化学合成工艺累积步骤繁琐，成本较高，因此生产上主要采用微生物发酵的方法获得。传统优化发酵条件提高红霉素A产量的方法耗时且不经济，不适合广泛应用。而通过基因工程的方法，在糖多孢红霉菌中通过失活某些调控基因或增加某些合成基因的拷贝数获得改造的红霉素高产菌株，有很好的前景。糖多孢红霉菌合成基因簇中不存在调控基因，而通过基因工程途径去改造糖多孢红霉菌的基因获得高产菌株只能从整个基因组中改造其它的调控基因。目前已报道的有参与糖多孢红霉菌孢子形态分化的SACE_7040和SACE_0012，以及调控红霉素合成的SACE_5599、SACE_3986、SACE_7301、SACE_3446、BldD(SACE_2077)、PccD(SACE_3396)和SACE_Lrp(SACE_5388)等。2005年，Ramos等以序列相似性、结构和功能为标准将原核生物转录调控子分成LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Coldshock、GntR和Crp共16个家族。其中TetR家族调控基因在DNA结合结构域上有高度的保守性，参与调控多药抗性和抗生素生物合成等重要生理活动。近年来发现了多种参与抗生素产量和放线菌形态分化的TetR家族转录调控子，表明TetR家族调控基因在放线菌次级代谢及抗生素生物合成中的重要性。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法，通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活负调控基因SACE_5754或过量表达SACE_5754靶基因SACE_0388和SACE_6149，提高糖多孢红霉菌的红霉素产量。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法，其是通过SACE_5754基因产物可负调控红霉素生物合成，在糖多孢红霉菌中失活SACE_5754基因，以提高红霉素产量。进一步的，在糖多孢红霉菌中过量表达SACE_5754靶基因SACE_0388和SACE_6149，以提高红霉素产量。所述方法中以糖多孢红霉菌SACE_5754基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的相关基因进行失活、增加拷贝、提高表达量的办法在糖多孢红霉菌中构建红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素或其中间产物和衍生物。所述构建红霉素高产菌株的技术方法为：通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活SACE_5754基因，并过量表达其靶基因SACE_0388和SACE_6149，获得红霉素高产工程菌株，提高了红霉素生物合成的产量，用所述菌株发酵生产红霉素。本专利技术的优点是：本专利技术研究中筛选到了红霉素生物合成负调控子SACE_5754，通过基因工程途径失活糖多孢红霉菌染色体上SACE_5754基因，并在SACE_5754缺失突变株中，过量表达SACE_5754靶基因SACE_0388和SACE_6149，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素产量提供技术支持。糖多孢红霉菌A226中失活SACE_5754基因时，红霉素产量提高了41％；在ΔSACE_5754缺失突变株中回补SACE_5754基因，红霉素产量得到恢复；在A226中增加SACE_5754的拷贝数，红霉素产量下降31％，从而表明SACE_5754是一个参与红霉素生物合成的负调控因子。在A226中对SACE_5754的靶基因SACE_0388和SACE_6149进行过量表达，红霉素产量分别提高了32％和28％。进一步在ΔSACE_5754中过量表达SACE_0388和SACE_6149，相比ΔSACE_5754的红霉素产量分别提高83％和50％。以红霉素高产菌株WB作为出发菌株，缺失SACE_5754基因，所获得的突变株WBΔSACE_5754较WB红霉素产量提高19％。在WBΔSACE_5754中单独过量表达SACE_0388和SACE_6149，红霉素产量分别提高42％和30％，进一步在WBΔSACE_5754中同时过量表达SACE_0388和SACE_6149，红霉素产量提高了64％。附图说明图1所示为本专利技术的染色体片段同源重组技术示意图及缺失突变株的PCR验证，其中：(A)ΔSACE_5754突变体构建示意图；(B)ΔSACE_5754突变体的PCR鉴定：SACE_5754基因(624bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度变为1652bp；M：5000bpDNAMarker。图2所示为原始菌株A226及缺失突变株ΔSACE_5754的表型分析，其中：(A)A226出发菌株和ΔSACE_5754突变株发酵液的抑菌分析；(B)ΔSACE_5754突变株和野生型A226菌株的孢子生长情况，其中1：A226菌株，2：ΔSACE_5754突变株，3：ΔbldD(影响糖多孢红霉菌孢子形态分化菌株)；4：过表达菌株A226/pIB139-5754；(C)ΔSACE_5754突变株和野生型A226菌株菌丝体的生物量测定。图3所示为出发菌株A226、缺失突变株ΔSACE_5754、缺失回补菌株ΔSACE_5754/pIB139-5754及回补空载对照菌株A226/pIB139、过表达菌A226/pIB139-5754及过表达空载对照菌株A226/pIB139红霉素A的HPLC分析。图4所示为ΔSACE_5754与出发菌株A226中相关基因转录分析，SACE_5754缺失突变株中，红霉素生物合成酶基因eryAI(SACE_0721)和红霉素抗性基因ermE(SACE_0733)转录水平有显著提高。图5所示为SACE_5754对其靶基因分子调控作用，其中：(A)SACE_5754可能靶基因的周边基因信息；(B)SACE_5754与P0388-0389的EMSA分析；(C)SACE_5754与P3599的EMSA分析；(D)SACE_5754与P6148-6149的EMSA分析；(E)SACE_5754的基因缺失对其靶基因转录的影响。图6所示为SACE_5754可能靶基因SACE_0388、SACE_0649和SACE_3599与红霉素生物合成相关性，其中：(A)SACE_0388基因缺失、回补与过表达菌株的红霉素产量；(B)SACE_6149基因缺失、回补与本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，其是通过SACE_5754基因产物可负调控红霉素生物合成，在糖多孢红霉菌中失活SACE_5754基因，以提高红霉素产量。
【技术特征摘要】
1.一种通过糖多孢红霉菌SACE_5754基因途径提高红霉素产量的方法，其特征在于，其是通过SACE_5754基因产物可负调控红霉素生物合成，在糖多孢红霉菌中失活SACE_5754基因，以提高红霉素产量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在糖多孢红霉菌中过量表达SACE_5754靶基因SACE_0388和SACE_6149，以提高红霉素产量。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以糖多孢红霉菌SACE_575...
【专利技术属性】
技术研发人员：张部昌，储祖灵，吴杭，汪焰胜，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34
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