本发明专利技术提供用于同时检测HTLV‑Ⅰ和HTLV‑Ⅱ的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’‑AGTGCCAAAGACCCTTCCTGGGCCTCT‑3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’‑CCTTATATCAGAGGCCGAA‑3’；下游引物序列为5’‑TCTGGCAGCCCATTGTCAA‑3’。本发明专利技术通过提取待检测样品中的DNA，再结合特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中HTLV‑1和HTLV‑2的目的。本方法用一份样本就可同时检测HTLV‑1和HTLV‑2感染状况，在成本和效率上均适合用于大规模血筛工作。
Specific primers and probes for detecting HTLV- I and HTLV- II and detection kit for fluorescent quantitative PCR
The present invention provides specific primers and probes for simultaneous detection of HTLV_I and HTLV_II. The probe sequence is: 5'AGTGCCAAAGACCCTCTGGGGGCCTCT_3'; The specific primer is the following sequence or a complementary sequence of the sequence: the upstream primer sequence is 5' The sequence is 5 'TCTGGCAGCCCATTGTCAA 3. The invention can accurately quantify HTLV_1 and HTLV_2 in the samples to be tested by extracting DNA from the samples to be tested, combining with specific primers and probes and real-time fluorescence quantitative PCR detection technology. This method can detect both HTLV_1 and HTLV_2 infection with one sample. It is suitable for large-scale blood screening in terms of cost and efficiency.
【技术实现步骤摘要】
用于检测HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ的特异性引物和探针及荧光定量PCR检测试剂盒
本专利技术属于分子生物学和体外诊断试剂
，具体涉及用于检测HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ的特异性引物和探针及荧光定量PCR检测试剂盒。
技术介绍
人类T淋巴细胞白血病病毒是最早被发现的人类逆转录病毒，一共包括四种亚型。其中HTLV-1和HTLV-2的感染流行较多见，分别是引起成人T细胞白血病和淋巴瘤的病原体。而HTLV-3和HTLV-4感染较少见。HTLV-1和HTLV-2可通过垂直途径，性接触和肠道外血液传播、静脉用药途径进行传播，在全球均有流行。我国属于HTLV非流行区，但自1984年以来已陆续发现感染者。2004年，位于高流行区域的厦门，成为我国的第一个对献血源进行HTLV-1/2筛查的城市。在严重出血时或者患有严重贫血、白血病、骨髓纤维化等疾病时，人们不得不接受输血。但在输血的同时也承担着被感染其他疾病的危险。引致输血传播性疾病中，HBV、HCV、HIV是对输血安全性构成严重威胁的主要病毒，HBV在我国人群中感染率高达10.3％，严重威胁我国的输血安全。在经血传播病原体筛查上，目前我国血液筛查仅含HIV、HBV、HCV、梅毒4种病原体，而发达国家除这4种病原体外，还有HTLV、WNV、B19、HAV等；在筛查方法上，目前我国主要采用血清学方法，而发达国家早已普遍采用分子生物学方法，检测灵敏度得到了很大的提高，经血传播病原体的风险仅为我国的1/10左右。我国与发达国家在血液安全上的差距仍在不断扩大。目前，国内开展了HTLV-I感染的血清流行病学调查。早期检测主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)、明胶颗粒凝集法(PA)和间接免疫荧光法(IIF)等，实践表明，检测结果存在一些假阳性和假阴性问题，且特异性较差。由于宿主免疫缺陷时，常规血清学检测就可能测不到抗体。HTLV-I感染时，HTLV-I前病毒DNA可以整合于CD4+细胞染色体DNA中的随意位置，由于tax等基因的作用，在感染早期产生T细胞多克隆扩增，某些克隆转化为恶性肿瘤细胞后，产生不同的疾病，此时就不再需要病毒的表达了，因此HTLV-I感染发病后，往往在血中或病变的细胞中不易检测到病毒。因此，为了获得更加可靠的HTLV诊断资料，前病毒DNA的PCR检测是必要的，PCR法不失为一种较为快速、准确检测嗜人T细胞白血病病毒感染的有效方法之一，有利于提高检测和研究水平。实时荧光定量PCR(FluorescencequantitativePCR)技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，它相对常规PCR技术先进、操作简便，利用实时荧光定量PCR技术能够实现实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，因此非常适合临床检测。实时荧光定量PCR技术有很多分支，其定量方式也不同，主要分为荧光染料嵌入技术、荧光探针技术和自身淬灭荧光技术等。荧光染料嵌入技术是利用SYBRgreenI嵌入DNA双链是荧光强度增加的特性，将荧光信号引入双链DNA，该方法特异性较差，结果常受到引物二聚体的存在的干扰而导致假阳性等问题，因此不适合用于血液筛查。而荧光探针技术如Taqman技术、分子信标技术等因为其特异性比荧光染料嵌入技术和自身淬灭荧光技术要好，因此更适合血液筛查使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于本专利技术采用基因克隆技术，将HTLV的LTR基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有LTR基因的DNA片段的重组质粒，以此作为标准品。根据HTLV的LTR的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。本专利技术的引物和探针能够高敏感和特异性的同时检测HTLV-1和HTLV-2。本专利技术的第一个目的是提供用于同时检测HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’-AGTGCCAAAGACCCTTCCTGGGCCTCT-3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’-CCTTATATCAGAGGCCGAA-3’；下游引物序列为5’-TCTGGCAGCCCATTGTCAA-3’。作为优选，所述探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、HEX、VIC中的一种，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA、DABCYL、BHQ中的一种。作为优选，所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。本专利技术的第二个目的是提供一种用于同时检测HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ的实时荧光定量PCR试剂盒，所述实时荧光定量PCR试剂盒包括权利要求1-3任一所述的特异性引物和探针。作为优选，在10μlPCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.1μl，所述下游引物的用量为0.1μl，所述探针的用量为0.2μl。作为优选，所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括系列浓度标准品、阳性对照；所述标准品是将HTLV的LTRrDNA基因与载体连接，转化至感受态细胞中诱导表达，提取重组质粒，将重组质粒定量后稀释，得到系列浓度标准品。本专利技术的第三个目的是提供上述特异性引物和探针、实时荧光定量PCR试剂盒在如下任一中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的：(1)定性或定量检测或辅助检测HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ；(2)制备定性或定量检测或辅助检测HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ的产品。本专利技术的第四个目的是提供一种定量检测HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ的方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。本专利技术提供用于对HTLV-1和HTLV-2进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检测样品中的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中HTLV-1和HTLV-2的目的。本方法的建立对HTLV的血液筛查有重要价值，用一份样本就可检测HTLV-1和HTLV-2感染状况，减轻了患者取多份样本的痛苦、降低了取样过程发生感染的可能性、减轻了患者的经济负担、降低了医务人员的工作量，在成本和效率上均适合用于大规模血筛工作。同时，我们认为HTLV病原体的数量可能会影响它的致病性，且只有当病原体的数量超过一定范围其致病性才会出现。目前通过HTLV的常规检测技术无法有效定量病原体。采用本专利技术方法能够对HTLV的拷贝数进行精确定量，对HTLV的致病机理研究和临床治疗都具有重要意义。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为本专利技术引物和探针体系优化实验结果。图2为本专利技术标准品的标准曲线。图3为本专利技术灵敏度实验结果。图4为本专利技术HTLV特异性实验结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物、探针和所用序列测定工作均由生本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于同时检测HTLV‑Ⅰ和HTLV‑Ⅱ的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针序列为：5’‑AGTGCCAAAGACCCTTCCTGGGCCTCT‑3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’‑CCTTATATCAGAGGCCGAA‑3’；下游引物序列为5’‑TCTGGCAGCCCATTGTCAA‑3’。
【技术特征摘要】
1.用于同时检测HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针序列为：5’-AGTGCCAAAGACCCTTCCTGGGCCTCT-3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’-CCTTATATCAGAGGCCGAA-3’；下游引物序列为5’-TCTGGCAGCCCATTGTCAA-3’。2.根据权利要求1所述的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM、TET、JOE、HEX、VIC中的一种，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA、DABCYL、BHQ中的一种。3.根据权利要求1所述的特异性引物和探针，其特征在于：所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。4.一种用于同时检测HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒包括权利要求1-3任一所述的特异性引物和探针。5.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：在10μlPCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.1μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴玲，车团结，徐红，陈游，王晓燕，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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